[發明專利]轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210128803.6
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN102634593A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 李志勇;蔡穎;陳源樹;唐羿;肖艷文;石磊
• 申請（專利權）人: 廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測引物組，包括外引物1、外引物2、內引物1和內引物2，其核苷酸序列分別如下所示：

外引物1：GTCGTCGATGCATATGTGT（SEQ?ID?No：1）；

外引物2：AATTCTCGTACGTACAGCAC（SEQ?ID?No：2）；

內引物1：GTCATCCATGAGTCAACCGTGTTACCTGCTGCTGGCTTAT（SEQ?ID?No：3）；

內引物2：AGATAGTAGTAGCGGCTCGTCAAATAAGGTGGAATCAGTCGC（SEQ?ID?No：4）。

2.轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括引物液、反應液、DNA聚合酶和對照，其特征在于：

（1）引物液：含有權利要求1所述的引物組，濃度分別為4～6μM外引物1、4～6μM外引物2，32～48μM內引物1、32～48μM內引物2；

（2）反應液：含有10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO4水溶液，三者的體積比是7～9：4～6：2；

（3）DNA聚合酶：濃度為7～9U/μl；

（4）對照：陽性對照為轉基因玉米EVENT98140的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。

3.根據權利要求2所述的轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述引物液中含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM內引物1、40μM內引物2。

4.根據權利要求2所述的轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶，濃度為8U/μl。

5.根據權利要求2所述的轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述反應液中，10mM?dNTP：10×ThermoPol反應緩沖液：150mM?MgSO4＝8：5：2體積比。

6.利用權利要求2～5任一項所述的試劑盒檢測轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的方法，包括如下步驟：

（1）待檢樣品DNA的提?。翰捎肅TAB法提取純化樣品DNA；

（2）恒溫基因擴增反應：在200ul?PCR管配制反應體系：引物液1μl，反應液?12.5μl，DNA聚合酶1μl，待檢DNA?2～5μl，用滅菌去離子水補齊到25μl；設置陽性對照反應時，用轉基因玉米EVENT98140的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63～65℃反應60～90min，并在80℃持續2min；

（3）結果判斷：通過觀察反應管內沉淀的濁度變化來判斷擴增結果。

7.根據權利要求2～5任一項所述的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen?I。

8.利用權利要求7所述的試劑盒檢測轉基因玉米EVENT98140及其衍生品種的方法，包括如下步驟：

（1）待檢樣品DNA的提取：采用CTAB法提取純化樣品DNA；

（2）恒溫基因擴增反應：在200ul?PCR管配制反應體系：引物液1μl，反應液?12.5μl，DNA聚合酶1μl，待檢DNA?2～5μl，用滅菌去離子水補齊到25μl；設置陽性對照反應時，用轉基因玉米EVENT98140的DNA或含目的基因的大腸桿菌質粒DNA替代待檢DNA，設置陰性對照反應時，用不含目的基因的反應混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63～65℃反應60～90min，并在80℃持續2min；

（3）結果判斷：在上述反應管中加入1～2μl顯色劑，混勻，根據顯色結果來判斷擴增結果。