[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210128792.1
• 申請(qǐng)日: 2012-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102634590A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高東微;易敏英;劉靜宇;唐大運(yùn);肖艷文;石磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

1.轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)引物組，包括外引物1和外引物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示：

外引物1：CCTGTAGCAATGGCAACA（SEQ?ID?No：1）；

外引物2：CGTGTAGATAACTACGATACGG（SEQ?ID?No：2）；

內(nèi)引物1：TTATCCGCCTCCATCCAGTCTACTGGCGAACTACTTACTCTA（SEQ?ID?No：3）；

內(nèi)引物2：CTTCCGGCTGGCTGGTTTAGTGCTGCAATGATACCG（SEQ?ID?No：4）。

2.轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，包括如下成分：

（1）引物液：含有權(quán)利要求1所述的引物組，濃度分別為4～6μM外引物1、4～6μM外引物2，32～48μM內(nèi)引物1、32～48μM內(nèi)引物2；

（2）反應(yīng)液：含有10mM?dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM?MgSO4水溶液，三者的體積比是7～9：4～6：2；

（3）DNA聚合酶：濃度為7～9U/μl；

（4）對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照為轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述引物液中含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM內(nèi)引物1、40μM內(nèi)引物2。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶，濃度為8U/μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述反應(yīng)液中，10mM?dNTP：10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液：150mM?MgSO4＝8：5：2體積比。

6.利用權(quán)利要求2～5任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的方法，包括如下步驟：

（1）待檢樣品DNA的提取：采用CTAB法提取純化樣品DNA；

（2）恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)：在200ul?PCR管配制反應(yīng)體系：引物液1μl，反應(yīng)液?12.5μl，DNA聚合酶1μl，待檢DNA?2～5μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63～65℃反應(yīng)60～90min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）結(jié)果判斷：通過(guò)觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。

7.根據(jù)權(quán)利要求2～5任一項(xiàng)所述的LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于：還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen?I。

8.利用權(quán)利要求7所述的試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127及其衍生品種的方法，包括如下步驟：

（1）待檢樣品DNA的提取：采用CTAB法提取純化樣品DNA；

（2）恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)：在200ul?PCR管配制反應(yīng)體系：引物液1μl，反應(yīng)液?12.5μl，DNA聚合酶1μl，待檢DNA?2～5μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA；將配制好的PCR管混勻后離心，并于63～65℃反應(yīng)60～90min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）結(jié)果判斷：在上述反應(yīng)管中加入1～2μl顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果。