[發(fā)明專利]基于熒光偏振的ERCC1基因第ll8位密碼子單核苷酸多態(tài)性均相檢測法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210127673.4
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN102676661A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張菊;姜英浩;梁平;王萌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 西安新思維專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 61114
• 代理人: 黃秦芳

技術(shù)領(lǐng)域：?

本發(fā)明涉及ERCC1基因Exon4第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性的檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種均相檢測法，其通過檢測改變的熒光偏振值以監(jiān)測樣品中存在的ERCC1基因Exon4第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性。

背景技術(shù)：?

單核苷酸多態(tài)性（SNP）指在某一人群的正常個體的基因組內(nèi)特定核酸位置上有著不同堿基，是人類DNA序列的差異，即染色體基因組序列中單核苷酸改變時發(fā)生的DNA序列的多態(tài)性變化，SNPs也被稱作雙等位基因標(biāo)記。人類基因組30億個堿基中，大約每300到500個堿基就有一個SNP發(fā)生，整個人類基因組大約有2000萬SNP。SNP既能在編碼基因又能在非編碼基因中發(fā)生，對人類個體的表型（形態(tài)、代謝和免疫狀態(tài)等），個體對環(huán)境致病因素的易感性、抵抗力、藥物和治療的反應(yīng)敏感性產(chǎn)生重大影響，因此，其檢測對生物學(xué)研究、藥物開發(fā)、醫(yī)學(xué)診斷、生物醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)發(fā)展有重要意義。

DNA損傷修復(fù)是個復(fù)雜的過程，通過一系列的DNA修復(fù)途徑完成，包括核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)途徑等。ERCC1是堿基切除修復(fù)途徑中的重要基因，在DNA修復(fù)途徑中起到了關(guān)鍵性作用，其正常表達(dá)是維持該修復(fù)功能的分子基礎(chǔ)。ERCC1?codonl18?位于第4外顯子，是一個沉默SNP，即C/T轉(zhuǎn)換都編碼同樣的氨基酸天門冬氨酸(Asp)，C/T轉(zhuǎn)換可能與密碼子選擇減半、ERCC1?mRNA產(chǎn)物及隨后的蛋白翻譯降低有關(guān)，降低了DNA修復(fù)能力，可能與個體腫瘤易感性密切相關(guān)。同時，DNA修復(fù)能力是影響鉑類藥物的療效的重要原因。鉑類藥物(順鉑、卡鉑)是化療的一類重要藥物。ERCC1與著色性干皮病基因形成的異源二聚體，能在鉑類藥物引起的DNA損傷位點的5’端切開DNA單鏈，保證DNA的修復(fù)過程的繼續(xù)進(jìn)行，為細(xì)胞存活所必需。因此，基因多態(tài)不僅與腫瘤的化療療效有關(guān)，對預(yù)后也有影響。在腫瘤的治療過程中，DNA修復(fù)能力增強影響了抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮，易產(chǎn)生耐藥性；DNA修復(fù)能力下降有助于有抗腫瘤活性的鉑-DNA加合物功能的持續(xù)存在，從而對預(yù)后產(chǎn)生好的影響。已有很多文獻(xiàn)報道ERCC1的SNP與鉑類藥物化療敏感性存在明顯關(guān)系，ERCC1(118)C／T單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌患者鉑類藥物化療后的生存期有顯著相關(guān)性，ERCC1(118)C／T和T／T基因型患者化療后的生存期及化療敏感性明顯高于攜帶C／C基因型的患者。ERCC1(118)SNP與鉑類藥物化療后生存期存在一定的相關(guān)性有可能作為鉑類藥物化療后生存期的預(yù)測指標(biāo)。提示ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性的檢測不僅可廣泛用于生物學(xué)研究，也能預(yù)警腫瘤發(fā)生、預(yù)測化療療效，為腫瘤早期診斷、預(yù)后判定及指導(dǎo)預(yù)見性個體化用藥提供依據(jù)。而且ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性不僅存在于組織中，在外周血、積液和痰液中均可檢出，這一優(yōu)點對相關(guān)的生物學(xué)學(xué)研究及開展早期、敏感無創(chuàng)的診斷意義重大。?

目前，ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性分析方法有很多，RFLP、等位基因特異的寡核苷酸雜交、寡核苷酸連接分析、等位基因特異的PCR、DNA測序、基因芯片、TDI-FP等技術(shù)都可分別進(jìn)行檢測，但這些方法涉及擴(kuò)增、消化純化、滅活、雜交延伸分管等步驟，多需要電泳和多步后處理，費時費力而效率有待提高。而且在操作過程因需要更換反應(yīng)管而易發(fā)生污染,影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。或儀器設(shè)備昂貴，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。?

因此，需要獲得一種操作簡便、特異準(zhǔn)確、易標(biāo)準(zhǔn)化和自動化、低成本的ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性檢測新方法。?

本發(fā)明的實施方案提供了一種測定樣品中ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態(tài)性的均相檢測法，該方法以熒光偏振的測量為基礎(chǔ)。熒光偏振技術(shù)的原理如下：具有較低分子量的熒光探針由于其快速旋轉(zhuǎn)而具有較小偏振度，而具有較大分子量的熒光探針由于其慢速旋轉(zhuǎn)而具有較大偏振度。因此，當(dāng)與較大分子結(jié)合時，熒光團(tuán)的偏振度增大，熒光偏振數(shù)值增加。?

發(fā)明內(nèi)容：?