[發明專利]基于熒光偏振的ERCC1基因第ll8位密碼子單核苷酸多態性均相檢測法

有效

• 申請號: 201210127673.4
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN102676661A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張菊;姜英浩;梁平;王萌
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 黃秦芳

1.一種用于測定樣品中ERCC1基因第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態性的均相檢測法，所述均相檢測法包括下列步驟：（1）從樣品中得到提取物：使用一種試劑或試劑盒從待測樣品中提取基因組DNA，并純化，得到純化的提取物；?（2）擴增結合：將上述純化的提取物加入反應試劑進行擴增結合，所述反應試劑包括10倍的PCR緩沖液,濃度各為?2.0～2.5mmol/L的dNTP(dGTP、dCTP、dATP和dTTP)，2.0～3.5mmol/L的MgCl2，1-5U/μl的TaqDNA聚合酶，濃度為0.2-2.0μmol/L的ERCC1基因第4個外顯子涵蓋第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態性區DNA的上游引物、下游引物，以及濃度為0.05-0.2μmol/L的ERCC1基因Codon118?C/T單核苷酸多態性的帶熒光標記的DNA探針，所述反應條件是：94-96℃變性4-10min后，95℃孵育5-40秒，53-63℃孵育15-60秒，72℃孵育10-60秒，35-45個循環，最后室溫孵育；（3）檢測：檢測反應溶液的熒光偏振FP值，SPSS軟件計算FP均值(means)和標準差(S.D.)，t檢驗統計陰、陽性對照反應終液FP值分布:最低檢測下限陽性對照反應終液FP值+FP標準差(S.D.)<陰性對照反應終液FP均值-FP標準差(S.D.)，陽性臨界值Cut-off=最低檢測下限陽性對照FP均值(means)，陰性臨界值Cut-off=最低檢測下限陽性對照FP均值(means)+FP標準差(S.D.)，待測樣品FP值與Cut-off值比較即知ERCC1基因Codon118單核苷酸多態性：

待測樣品FP值>陰性臨界值?Cut-off值，靶位點與反應中所加入相應熒光標記的探針序列非同源，

待測樣品FP值＜陽性臨界值Cut-off值，靶位點與反應中所加入相應熒光標記的探針序列同源,

待測樣品FP值>陽性臨界值Cut-off值，但同時待測樣品FP值＜陰性臨界值Cut-off，則靶位點狀態無法判斷，需重新檢測。

2.權利要求1?的檢測法，其中步驟（1）包括：在試劑或試劑盒中進行處理獲取基因組DNA；其中所述獲取基因組DNA的試劑或試劑盒為內含蛋白酶K、細胞裂解液的DNA提取液，及內含酚／氯仿、乙醇或DNA純化用DEAE樹脂或DNA吸附柱的試劑，回收的DNA通過PCR來擴增，在PCR擴增過程中，ERCC1基因第4個外顯子涵蓋第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態性保持不變。

3.權利要求1或2的檢測法，其中所述引物為ERCC1基因第4個外顯子涵蓋第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態性區DNA的通用的上游引物、下游引物，所述5’端帶熒光標記的探針為ERCC1基因第4個外顯子涵蓋第ll8位密碼子Codon118單核苷酸多態性同源的探針，能夠與所獲得的擴增子結合以產生能夠檢測的熒光偏振值變化；熒光偏振儀檢測所述各反應終液以獲得熒光偏振測量值；以及將熒光偏振測量值與特征性熒光偏振數值相比較，所述特征性熒光偏振數值為對照反應終液FP均值、Cut-off值。