[發明專利]一種新型耐高溫脂肪酶基因及其編碼產物

無效

• 申請號: 201210127232.4
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102732538A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 陸勇軍;龍思梅;龐柳;何磊
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及一種新型脂肪酶基因及其編碼產物，尤其是一種來自紅樹林土壤微生物的新型脂肪酶基因及其編碼產物。?

背景技術

脂肪酶是廣泛存在于動植物和微生物中的一種酶，在脂質代謝中發揮重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放含更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。除此之外，還有多種酶活性，如催化多種酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。脂肪酶反應條件溫和，具有優良的立體選擇性，并且不會造成環境污染，因此，在食品、皮革、醫藥、飼料和洗滌劑等許多工業領域中均有廣泛的應用。?

自然界中存在的微生物99％是不能培養的，因此從用傳統的培養技術分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免培技術，直接從環境微生物中提取基因組DNA，將其克隆到不同的細菌載體中，構建“metagenome文庫”，再從中進行篩選，是前景廣闊的篩選方法。?

發明內容

本發明的目的之一在于解決現有技術的不足之處而提供一種能夠編碼高催化效率、高穩定性和高抗逆性的脂肪酶的基因。?

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種新型耐高溫脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名為lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。?

上述所述的耐高溫脂肪酶基因通過以下方法制備所得：從紅樹林土壤宏基?因組文庫中隨機挑選4個陽性克隆子，測序，然后運用軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述耐高溫脂肪酶基因。?

所述脂肪酶基因lip34通過隨機篩選的方法從紅樹林宏基因組文庫中獲得，lip34為一個825bp大小的完整脂肪酶基因，利用BLAST在線比對其核苷酸序列進行同源性搜索分析表明，所述耐高溫脂肪酶基因lip34與已知基因不存在相似性。?

本發明的另一個目的在于提供一種含有如上所述新型耐高溫脂肪酶基因的重組質粒pET32a-lip34，根據脂肪酶基因lip34的序列設計引物，以提取的質粒pUC18-lip34為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物1經限制性內切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產物2，質粒pET32a經BamHI與XhoI雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即重組質粒pET32a-lip34。?

另外，本發明還提供一種含有上述所述新型耐高溫脂肪酶基因的表達載體，采用如下方法構建所得：采用電轉法，將上述所得的重組質粒pET32a-lip34轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養板上培養，挑取陽性轉化子，即得新型耐高溫脂肪酶基因的表達載體大腸埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。所述大腸埃希氏菌BL21-pET32a-lip34現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為：大腸埃希氏菌Escherichia?coli，保藏日期為2012年01月16日，保藏編號為CGMCCNo.5736。?

本發明的再一個目的是提供一種耐高溫重組脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：?

(1)重組質粒pET32a-lip34的構建：根據脂肪酶基因lip34的序列設計引物，以提取的質粒pUC18-lip34為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物1經限制性內切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產物2，質粒pET32a經BamHI與XhoI雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即重組質粒pET32a-lip34；?

(2)脂肪酶基因lip34表達載體的構建：采用電轉法，將重組質粒pET32a-lip34轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養板上培養，挑取陽性轉化子；?

(3)目的蛋白Lip34的誘導表達：將重組質粒轉化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，37℃倒置培養過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養基，37℃振蕩培養過夜，按體積比1∶100的比例轉接至新鮮的含氨芐青霉素抗性LB培養基，于37℃、200rpm培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8；加入IPTG誘導培養，培養后經鎳柱親和層析純化，即得重組脂肪酶Lip34。?

作為本發明一種耐高溫重組脂肪酶的制備方法的優選實施方式，所述步驟(3)中的LB液體培養基含有100μg/mL氨卞青霉素。?