[發(fā)明專利]一種新型耐高溫脂肪酶基因及其編碼產(chǎn)物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210127232.4
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102732538A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸勇軍;龍思梅;龐柳;何磊
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種新型耐高溫脂肪酶基因，其特征在于，所述脂肪酶基因命名為lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述耐高溫脂肪酶基因的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：從紅樹林土壤宏基因組文庫中隨機挑選4個陽性克隆子，測序，然后運用軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述耐高溫脂肪酶基因。

3.一種含有如權(quán)利要求1所述新型耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pET32a-lip34，根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計引物，以提取的質(zhì)粒pUC18-lip34為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物1，凝膠回收產(chǎn)物1經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒pET32a-lip34。

4.一種含有如權(quán)利要求1所述的新型耐高溫脂肪酶基因的表達載體，其特征在于，采用如下方法構(gòu)建所得：采用電轉(zhuǎn)法，將權(quán)利要求3所得的重組質(zhì)粒pET32a-lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，將細菌懸浮液恢復培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得耐高溫脂肪酶基因的表達載體大腸埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。

5.一種耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)重組質(zhì)粒pET32a-lip34的構(gòu)建：根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計引物，以提取的質(zhì)粒pUC18-lip34為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物1，凝膠回收產(chǎn)物1經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒pET32a-lip34；

(2)脂肪酶基因lip34表達載體的構(gòu)建：采用電轉(zhuǎn)法，將重組質(zhì)粒pET32a-lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，將細菌懸浮液恢復培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子；

(3)目的蛋白Lip34的誘導表達：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按體積比1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基，于37℃、200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8；加入IPTG誘導培養(yǎng)；培養(yǎng)后經(jīng)鎳柱親和層析純化，即得重組脂肪酶Lip34。

6.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的LB液體培養(yǎng)基含有100μg/mL氨卞青霉素。

7.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中加入的IPTG的濃度為0.2mmol/L，誘導溫度為30℃，誘導時間為5h。

8.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括步驟(4)：目的蛋白Lip34的檢測：取1.5mL誘導后的菌液，12000×g離心1min，棄上清，用50μL50mmol/L的Tris-HCl(pH?8.0)重懸沉淀，加入等體積4×Loading?buffer，于沸水中煮10min，13000×g離心10min；取10μL上清液進行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為10％，濃縮膠濃度5％。

9.一種采用如權(quán)利要求5所述方法制備得到的耐高溫重組脂肪酶Lip34。

10.如權(quán)利要求9所述的耐高溫重組脂肪酶Lip34，其特征在于，所述Lip34的脂肪酶水解活性為0.34U/mg，Lip34最適溫度為85℃，最適pH為11.0。