[發(fā)明專利]利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫(kù)中篩選β-葡萄糖苷酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210127162.2
• 申請(qǐng)日: 2012-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN102732597A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃黎鋒;李海峰;藍(lán)袁洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/34
• 分類號(hào): C12Q1/34;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫(kù)中篩選β-葡萄糖苷酶的方法。

(二)背景技術(shù)

β-葡萄糖苷酶可以催化水解多種β-葡萄糖苷鍵，具有底物廣譜性和多種生物功能，比如：

(1)β-葡萄糖苷酶用于纖維素的水解

纖維素是自然界最豐富的碳資源，從纖維素分解為葡萄糖需要3種酶協(xié)同作用。β-葡萄糖苷酶可以將纖維二糖水解為葡萄糖，而纖維素酶組分中β-葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成為纖維素酶解的瓶頸。因此篩選或者通過(guò)基因工程改造得到高活性的β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維素有效降解具有重要意義。

(2)β-葡萄糖苷酶制備高生物活性苷元的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，自然界多種具有高生物活性的物質(zhì)，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其活性。利用β-葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。例如，人參皂甙是人參中的主要有效成分，含量約4％，但并非所有的人參皂甙都有很高的生物活性。如具有強(qiáng)烈抗癌作用的人參皂甙Rh2在人參中的質(zhì)量比僅為10^-5。而以低活性的人參二醇類皂甙Rg3為底物，β-葡萄糖苷酶可以水解掉一個(gè)葡萄糖后得到人參皂甙Rh2。例如，大豆異黃酮具有的很多重要的生理功能，研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮苷元的生理活性遠(yuǎn)比其相應(yīng)糖苷的活性高。大豆異黃酮中97％～99％是以大豆異黃酮糖苷形式存在，苷元形式僅為大豆異黃酮總量的1％～3％。利用β-葡萄糖苷酶可以水解大豆異黃酮糖苷為高生物活性的大豆異黃酮苷元。

傳統(tǒng)的β-糖苷酶篩選，比如以纖維二糖為唯一碳源的篩選方法，主要是對(duì)β-糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選，獲得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列較慢，也就不能夠重組為具有高效、高適應(yīng)性的工程菌。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫(kù)中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，該方法篩選時(shí)間短，精度高，誤差少，且可以較快獲得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，進(jìn)一步重組為具有高效、高適應(yīng)性的工程菌。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫(kù)中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法為：(1)從富含纖維素資源的地點(diǎn)采集土樣，提取總DNA，構(gòu)建fosmid文庫(kù)，獲得富集菌液；(2)將富集菌液于含七葉苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，20～40℃培養(yǎng)12～24h進(jìn)行初篩，獲得菌落周圍呈現(xiàn)黑色的菌株；所述含七葉苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10～20g/L，七葉苷0.1～1g/L，檸檬酸鐵0.1～5g/L，氯霉素10～50mg/L，溶劑為水；(3)挑取步驟(2)獲得的菌落周圍呈現(xiàn)黑色的菌株接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)平板上，20～40℃培養(yǎng)12～24h進(jìn)行復(fù)篩，獲得復(fù)篩培養(yǎng)后的平板；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10～20g/L，氯霉素10～50mg/L，溶劑為水；(4)取3～10ml?4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(4-MUG)的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液均勻平鋪在步驟(3)獲得平板的上層，待瓊脂糖溶液凝固后，20～40℃培養(yǎng)0.1～1h，紫外燈下觀察菌落，菌落周圍顯熒光的，即獲得所述β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株，進(jìn)而獲得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，通過(guò)本領(lǐng)域公知的生物工程方法將β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列重組為各種工程菌；若無(wú)熒光的，即為假陽(yáng)性菌株；所述4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液的終濃度組成為：4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷0.1～1g/L，低熔點(diǎn)瓊脂糖1～10g/L，溶劑為水，所述低熔點(diǎn)瓊脂糖的凝膠溫度為24～28℃，優(yōu)選低熔點(diǎn)瓊脂糖Agarose?LM?GQT。

進(jìn)一步，步驟(2)所述含七葉苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中七葉苷的終濃度優(yōu)選為0.5g/L，檸檬酸鐵的終濃度優(yōu)選為2g/L。

步驟(2)所述富集菌液先進(jìn)行10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀釋(優(yōu)選10^-5倍稀釋)，再分別于含七葉苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩培養(yǎng)。

步驟(2)所述初篩溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。

進(jìn)一步，步驟(3)所述復(fù)篩溫度優(yōu)選為37℃，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為24h。

進(jìn)一步，步驟(4)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37℃，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為40min。