[發明專利]利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法

有效

• 申請號: 201210127162.2
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102732597A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 黃黎鋒;李海峰;藍袁洋
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于所述方法為：(1)從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取總DNA，構建fosmid文庫，獲得富集菌液；(2)將富集菌液于含七葉苷的基礎培養基中，20～40℃培養12～24h進行初篩，獲得菌落周圍呈現黑色的菌株；所述含七葉苷的基礎培養基的終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10～20g/L，七葉苷0.1～1g/L，檸檬酸鐵0.1～5g/L，氯霉素10～50mg/L，溶劑為水；(3)挑取步驟(2)獲得的菌落周圍呈現黑色的菌株接種至基礎培養基中，20～40℃培養12～24h進行復篩，獲得復篩后的平板；所述基礎培養基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10～20g/L，氯霉素10～50mg/L，溶劑為水；(4)取4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液均勻平鋪在步驟(3)獲得的平板上，20～40℃培養0.1～1h，紫外燈下觀察菌落，菌落周圍顯熒光的，即得所述β-葡萄糖苷酶產生菌株，進而獲得β-葡萄糖苷酶的DNA序列，若無熒光的，即為假陽性菌株；所述4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成為：4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷0.1～1g/L，低熔點瓊脂糖1～10g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖凝膠溫度為24～28℃。

2.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述含七葉苷的基礎培養基中七葉苷的終濃度為0.5g/L，檸檬酸鐵的終濃度為2g/L。

3.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述富集菌液先進行10^-5倍稀釋，再于含七葉苷的基礎培養基中進行初篩培養。

4.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述初篩溫度為37℃，培養時間為24h。

5.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(3)所述復篩溫度為37℃，培養時間為24h。

6.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述培養溫度為37℃，培養時間為40min。

7.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成為：4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷0.4g/L，低熔點瓊脂糖5g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖凝膠溫度為24～28℃。

8.如權利要求1所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液溫度降至40℃時均勻平鋪在步驟(3)獲得的復篩培養后的菌株的平板上。