[發(fā)明專利]在牛MSTN基因中引入移碼突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210126009.8
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102653764A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭宏;李光鵬;丁向彬;劉新峰;葛秀國;李吉霞
• 申請（專利權(quán)）人: 天津農(nóng)學(xué)院;內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓奎勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的基因工程技術(shù)，涉及一種通過基因打靶技術(shù)在牛MSTN基因中引入移碼突變的方法，該移碼突變是MSTN基因第4843bp到第4853bp共11bp缺失導(dǎo)致的。

背景技術(shù)

生長/分化因子-8(growth/difference?factor-8，GDF-8)是1997年美國JohnHopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mepherron和Lee等研究小鼠的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族時發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)因子基因，他們將這一基因命名為生長/分化因子-8，即GDF-8。通過試驗研究表明：GDF-8正常情況下編碼一種蛋白，這種蛋白呈現(xiàn)出骨骼肌生長的負調(diào)控因子活性，從而把它稱為肌生成抑制素(myostatin，即MSTN)。

牛的MSTN基因位于2號染色體著絲點與微衛(wèi)星標記(TGLA44)之間，距離著絲點微衛(wèi)星標記(BTA2)約2～3cm，它是骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)節(jié)因子，屬于TGF-β超家族成員，為不完全顯性遺傳。該基因含有2個內(nèi)含子和3個外顯子。第1個外顯子與第2個外顯子的長度分別是506bp和374bp；第3個外顯子的長度因poly(A)尾巴位點的不同而有所不同(1701bp、1812bp或1887bp)。兩個內(nèi)含子的長度分別為1840和2033bp。外顯子與內(nèi)含子連接區(qū)域序列遵守GT-AG規(guī)則。

MSTN基因在不同物種間有高度的保守性。McPheffon和Lee以小鼠MSTN保守的C-末端編碼序列為探針，對小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞及斑馬魚的MSTN的cDNA進行了克隆和測序，結(jié)果表明，各種動物的MSTN序列高度保守，其N-末端都有分泌必須的信號肽序列，都有類胰蛋白酶作用水解加工位點(RSRR)，都含有TGF-β的超家族的富含半胱氨酸的保守區(qū)，并且在大鼠、小鼠、人、豬、雞及火雞的水解加工位點后的C-末端完全相同，同源率為100％。而牛、綿羊、狒狒的成熟蛋白中也僅有1～3個氨基酸不同；斑馬魚的MSTN的基因序列保守性較差，與其他動物的C-末端的同源性為88％。

當該基因發(fā)生突變后，myostatin失活，失去生理功能。MSTN的生理功能是限制骨骼肌的生長，當它發(fā)生突變之后，這種限制作用就消失了，然后肌肉就表現(xiàn)過度發(fā)育，不僅肌纖維數(shù)目增多(hyperplasia)，而且直徑也增大(hypertrophy)。牛的肌肥大癥又稱肌纖維增生癥(myofibrehyperplasia，MH)或雙肌癥(double?muscling，DM)，是由持續(xù)提高胴體品質(zhì)的選育所產(chǎn)生的一種肌纖維肥大和骨骼肌數(shù)量增加的遺傳突變表型。比利時蘭牛(Belgian?Blue)是一種典型的具有雙肌表型的牛。Lee?Se-Jin等對比利時蘭牛的MSTN基因外顯子進行了PCR擴增、克隆和序列測定。結(jié)果表明，比利時蘭牛的MSTN基因發(fā)生了突變，在外顯子3上缺失了11個核苷酸，導(dǎo)致此位點后閱讀框架發(fā)生改變，并在此點后的第14個密碼子處終止了閱讀框架，從而使MSTN被截短。這種缺失位于C-端區(qū)第7個氨基酸上，使得MSTN失去了102個氨基酸，因此，翻譯出的是一個截斷的蛋白，不能發(fā)揮其抑制肌肉生成的生物學(xué)功能，從而表現(xiàn)出雙肌癥狀。

雙肌牛的表型特征是臀部、大腿、上臂、胸及起支撐作用的中前段肌肉群異常發(fā)達，皮下脂肪少，且有更多的脂肪沉積于肌纖維之間，皮膚薄，這些變化恰好符合人們所追求的高瘦肉率、肉質(zhì)香嫩的育種目標。在生產(chǎn)中用雙肌牛做終端父本所雜交改良的品種已經(jīng)給人們帶來了巨大的經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于MSTN基因的移碼突變對產(chǎn)肉性狀的影響，本發(fā)明的目的在于提供一種通過基因打靶將移碼突變引入牛MSTN基因組中的方法，借助此方法可以得到擁有雙肌癥狀的轉(zhuǎn)基因牛，以改善其產(chǎn)肉性狀，借此提高牛肉的品質(zhì)與產(chǎn)量。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種在牛基因中引入MSTN基因移碼突變的方法，包括以下步驟：

(1)帶有移碼突變的牛MSTN基因同源短臂的構(gòu)建：

合成構(gòu)建的同源短臂是從牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分內(nèi)含子2和絕大部分的外顯子3，但在第3外顯子上缺失第4843bp到第4853bp，共11bp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一個Xba?I酶切位點，3’端引入了一個Pme?I酶切位點。

(2)牛MSTN基因同源長臂的構(gòu)建：

合成構(gòu)建的同源長臂是從牛的MSTN基因的第1bp到第4740bp，包括1、2外顯子，內(nèi)含子1及部分內(nèi)含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一個Pac