[發明專利]在牛MSTN基因中引入移碼突變的方法

有效

• 申請號: 201210126009.8
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102653764A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 郭宏;李光鵬;丁向彬;劉新峰;葛秀國;李吉霞
• 申請（專利權）人: 天津農學院;內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓奎勇

1.一種在牛MSTN基因中引入移碼突變的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)帶有移碼突變的牛MSTN基因同源短臂的構建：

合成構建的同源短臂是從牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分內含子2和絕大部分的外顯子3，但在第3外顯子上缺失第4843bp到第4853bp，共11bp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一個Xba?I酶切位點，3’端引入了一個Pme?I酶切位點；

(2)牛MSTN基因同源長臂的構建：

合成構建的同源長臂是從牛的MSTN基因的第1bp到第4740bp，包括1、2外顯子，內含子1及部分內含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一個Pac?I酶切位點，3’端引入了一個Not?I酶切位點；

(3)打靶載體的構建：

①用Pac?I和Not?I雙酶切所述同源長臂及pFPC-1載體，通過連接酶連接，使所述同源長臂插入質粒載體pFPC-1的Pac?I和Not?I酶切位點；

②用Xba?I和Pme?I雙酶切所述同源短臂和步驟①獲得的插入有同源長臂的質粒載體pFPC-1，通過連接酶連接，使所述同源短臂插入到Xba?I和Pme?I酶切位點，得到打靶載體pFPC-MSTN；

(4)牛MSTN基因移碼突變的引入：

①用Pac?I或Pme?I單酶切處理所述打靶載體pFPC-MSTN使其線性化，用脂質體轉染試劑轉染牛體細胞，同源重組后使篩選標記基因Neo-TK及移碼突變引入牛MSTN基因中，用G418和DTA特性對成功進行同源重組的細胞株進行篩選；

②用含有重組酶Cre基因的腺病毒載體轉染293細胞，進行病毒包裝，通過反復凍融轉染293細胞收集病毒，利用收集的病毒感染步驟①所得的篩選后的細胞株，用Cre酶的活性刪除loxp位點當中的篩選基因Neo-TK，用GANC篩選出成功刪除Neo-TK后的細胞株；在?；蛑幸肓薓STN基因移碼突變。

2.根據權利要求1所述的在?；蛑幸隡STN基因移碼突變的方法，其特征在于：所述步驟(3)的①步中是用膠回收酶切產物得質粒載體pFPC-1；②步中是用膠回收酶切產物得到打靶載體pFPC-MSTN，然后通過轉化大腸桿菌DH5α，酶切鑒定連接效果。

3.根據權利要求1所述的在?；蛑幸隡STN基因移碼突變的方法，其特征在于：所述步驟(4)的①步中的用G418和DTA特性對成功進行同源重組的細胞株進行篩選是轉染后24-40小時加入G418對同源重組細胞進行篩選。

4.根據權利要求1所述的在牛基因中引入MSTN基因移碼突變的方法，其特征在于：所述步驟(4)的②步中的用含有重組酶Cre基因的腺病毒載體轉染293細胞是：首先構建含有重組酶Cre基因的載體pAdTrack-CMV，獲得質粒載體pAdTrack-Cre；然后將骨架載體pAd-Easy-1轉化BJ5183菌株，獲得pAd-Cre載體；然后利用Pac?I酶切線性化載體pAd-Cre，轉染293細胞。