[發明專利]一種生物有機肥發酵菌種S4的制備方法

無效

• 申請號: 201210125426.0
• 申請日: 2010-10-27
• 公開（公告）號: CN102943051A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 高勇;陳家任;楊樹;祖秉橋;李錫宏
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司湖北省公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C05F11/08;C12R1/07
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

本申請是名稱為“一種生物有機肥發酵菌種的制備方法”、申請號為201010538124.7、申請日為20101027專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及的是農業生物有機肥生產技術，特別是一種固態發酵制備煙草秸稈生物有機肥的菌種制備方法。?

背景技術

煙草是一種重要的經濟作物，在國民經濟中具有十分重要的作用。在我國煙草種植生產過程中，長期以來以化學肥料為主，造成土壤有機質數量銳減，團聚體數量和質量下降，通氣性退化，影響煙葉生產的產量和質量。另外，當煙葉采收后，在煙田中丟棄大量的廢棄煙草秸稈，最長時間可達五個月，增加次年煙田病蟲害，污染煙田生態環境。按照行業規定，應該集中煙草秸稈焚燒處理，但這樣會增加CO₂排放量，造成大氣環境污染。是一種不得而為之的辦法。?

現有技術中有借用一般農作物秸稈固體發酵技術把煙草秸桿發酵變成生物有機肥方法，但因煙草秸稈含有大量煙堿、又帶有大量有害病菌和病毒，這種方法沒有優選選微生物菌種，效果不好。常用的發酵細菌不適合在具有大量煙堿物質的條件下生存，不能夠進行有效發酵轉化，所以現有方法難于解決上述問題。如果能尋找一種耐強煙堿高溫微生物，具有在大量煙堿物質的條件下生存的發酵細菌，進行固態發酵，將廢棄煙草秸稈轉化成一種安全的生物有機肥，部分替代化學復合肥，回填到煙田。把煙草生產中的病蟲害、土壤退化、環境保護、資源利用和煙葉質量問題一并考慮，并加以利用。這樣，大大地有利于改善環境。?

發明內容

本發明的目的是提出一種能夠在高溫重煙堿條件下生存的固態發酵菌種的制備方法。將該耐溫耐煙堿的固態發酵菌種經培養和擴繁后，加入到廢棄的煙草秸稈混合物中，在自然條件下進行固態發酵，將煙草秸稈廢棄物轉化為煙草秸稈生物有機肥。?

具體步驟為：?

1、菌株分離篩選：從不同地區煙田的煙草秸稈中，分別取樣加入到含有煙堿的葡萄糖、蛋白胨，酵母膏，無機鹽的液體培養基中，在50～60℃高溫下，培養48小時。將培養液稀釋，涂布于含煙堿的蛋白胨，酵母膏的瓊脂培養皿中，在25～35℃下，培養24～36小時。挑取單菌落，分別并同時接種到蛋白胨、酵母膏、無機鹽的同一編號的液體或固體培養基中，在30℃下，培養24～30小時。提取離心上清培養液，加入鏈霉素、青霉素和羧甲基纖維素，在50℃下，保溫18小時，測定還原糖含量，分離篩選出S₄菌株。?

2、菌株分類鑒定及保藏?

根據伯捷氏手冊(第七版)和16SrRNA基因順序測定對S₄進行菌株的分類鑒定。?

S₄菌：根據S₄菌的菌落形態，細胞形態，生理生化試驗和16SrRNA基因序列測定結果，S₄菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens?S₄)。?

該菌株于2010年9月26日保藏于中國典型培養物保藏中心，名稱為解淀粉芽孢桿菌S4?(Bacillus?amyloliquefaciens?S4），保藏號：CCTCC?NO.M?2010249），地址：中國.武漢.武漢大學。?

該菌株的菌學特性。菌落粗糙，不透明，擴張，微帶黃色，細胞直徑＜1μm，桿狀，著色均勻，無夾膜，運動，革氏染色呈陽性；形成芽孢，芽孢橢圓形，中生不膨大，無伴孢晶體，接觸酶和氧化酶呈陽性，VP試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陽性，厭氧生長，可利用葡萄糖，木糖，甘露糖，L-阿拉伯糖，并產酸，水解淀粉，分解酪素；?不能利用乳糖，檸檬酸鹽，硝酸鹽還原試驗均為陽性；50℃下生長，7％NaCI下生長，PH5.7生長，VPPH＜6陽性，VPPH＞7陰性。?

該菌能在煙堿存在的條件下生長。?

3、種子培養。以S₄菌作為菌種，在種子三角瓶或發酵罐中加入培養基MD，其成分和比例如表1。?

表1菌株液體培養基?

種子培養條件：培養基滅菌后接入斜面母種，在28～30℃下，振蕩培養16～22小時；?

4、擴繁培養，在發酵罐中加入培養基MD，滅菌后按照發酵罐培養基的3～8％體積比接入上述培養物混合后作種子，擴繁培養條件：罐壓為0.4～0.6Mpa，罐溫為28～30℃，空氣流量為0.3～0.6(v/v/min)，攪拌器轉速為200rpm，擴繁培養18～24小時，當培養液的OD值為OD600nm下降0.02時終止發酵；?