[發明專利]一種糜蛋白酶的純化工藝

有效

• 申請號: 201210125352.0
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102618523A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 孫廷華;李全義;李娟;王朋田;李剛
• 申請（專利權）人: 山東眾山生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

技術領域????

本發明涉及生物制藥技術中糜蛋白酶領域，特別涉及一種糜蛋白酶的純化工藝。

背景技術???

糜蛋白酶是從牛胰臟或豬胰臟中提取分離純化得到的一種蛋白酶。它能切斷蛋白質肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，故能有效酶解蛋白質，因而具有清創消膿，消化膿汁和去除壞死組織，助長新生肉芽生長的功能。在臨床上主要用于抗炎消腫，有報道稱其在輔助抗癌方面也具有不錯效果。此外，在皮革工業上，糜蛋白酶常用于脫去動物皮上的毛等。

目前國內已對該酶做了大量的研究，提取純化工藝多采用鹽析多重結晶結合透析的方法。鹽析多重結晶純化能力弱，耗費時間長；低溫激活耗費時間長，激活效率低；透析工藝耗時長，不便于工業化生產；且得到的產品純度低，雜蛋白多，增加了用藥的不良反應；傳統工藝所得產品的酶活性一般在1000-1200單位/毫克左右，產品純度為80-85%。酶活性低，產品中的雜蛋白增加了過敏反應風險。因此，提高糜蛋白酶的純度，提高其活性可以提高該酶的用藥安全性，是研究人員需關注的問題。

發明內容???

為了解決以上糜蛋白酶活性含量低，純度低的問題，本發明提供了一種制得的糜蛋白酶活性含量高、純度高的糜蛋白酶的純化工藝。

本發明是通過以下方式實現的：

一種糜蛋白酶的純化工藝，包括以下步驟：

（1）取牛胰，將脂肪、結締組織除去，絞碎成胰漿；

（2）向胰漿中加入硫酸溶液進行鹽析，過濾；

（3）濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；

（4）過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾；

（5）濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進行超濾；

（6）濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；

（7）過濾，將濾餅溶于冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3-5倍，加硫酸調pH為2.0，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的2倍，調pH至5.0，25℃，孵育2-5?h，有晶體析出，過濾收集晶體；

（8）晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3-5倍，調節pH?7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4?h?；

（9）調節pH?至4.0，加入固體硫酸銨使達0.7飽和度，過濾收集沉淀；

（10）沉淀用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超濾膜進行超濾；

（11）將上述超濾脫鹽的料液加至已用0.05mol/L?NaAC?緩沖液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含0.2?mol/L?NaCl?的緩沖液洗柱，用3倍柱體積的含0.4?mol/L?NaCl?的緩沖液洗脫得洗脫液；

（12）將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，既得。

所述的純化工藝，步驟（3）中濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，加入硅藻土助濾。

所述的純化工藝，步驟（7）中用5N?NaOH調節pH至5.0，加入的硫酸為5N的硫酸。

所述的純化工藝，步驟（8）中胰蛋白酶加入量為5mg/100g晶體，加入晶體重量1倍的體積的pH?7.6、0.5?mol/L的磷酸鹽緩沖液，以5N?NaOH調節pH?7.6。

所述的純化工藝，步驟（10）中超濾時添加pH?3.0的冷純化水，至母液電導與0.05mol/L?NaAC?緩沖液電導相同為止。

冷純化水是指10℃以下的純化水。

本發明的有益效果：本發明的糜蛋白酶的純化工藝，使用超濾膜與離子交換柱的結合來純化糜蛋白酶，純化效果好，得到的產品純度高,降低了以往因產品中的雜蛋白而導致的過敏反應風險；本發明工藝得到的糜蛋白酶酶活性高，效價大于1500?U/mg，提高了該酶的用藥安全性。

附圖說明???

圖1為實施例1所得產品HPLC檢測純度圖。

具體實施方式

實施例1

（1）取新鮮牛胰10?kg，去除脂肪、結締組織等，用絞肉機絞碎成胰漿；

（2）加入20L（胰漿體積量的2倍）0.25?N硫酸溶液，于冷室中攪拌提取24h，過濾，濾餅用10?L冷的0.?25?N硫酸同法攪拌提取1h，過濾，合并兩次濾液；

（3）濾液攪拌并逐漸加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中低溫放置過夜；