[發(fā)明專利]一種糜蛋白酶的純化工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210125352.0
• 申請(qǐng)日: 2012-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN102618523A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫廷華;李全義;李娟;王朋田;李剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東眾山生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/64
• 分類號(hào): C12N9/64
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種糜蛋白酶的純化工藝，其特征在于包括以下步驟：

（1）取牛胰，將脂肪、結(jié)締組織除去，絞碎成胰漿；

（2）向胰漿中加入硫酸溶液進(jìn)行鹽析，過濾；

（3）濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；

（4）過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進(jìn)行超濾；

（5）濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進(jìn)行超濾；

（6）濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；

（7）過濾，將濾餅溶于冷純化水中，冷純化水的體積數(shù)為濾餅質(zhì)量數(shù)的3-5倍，加硫酸調(diào)pH為2.0，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數(shù)為濾餅質(zhì)量數(shù)的2倍，調(diào)pH至5.0，25℃，孵育2-5?h，有晶體析出，過濾收集晶體；

（8）晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數(shù)為晶體質(zhì)量數(shù)的3-5倍，調(diào)節(jié)pH?7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4?h?；

（9）調(diào)節(jié)pH?至4.0，加入固體硫酸銨使達(dá)0.7飽和度，過濾收集沉淀；

（10）沉淀用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超濾膜進(jìn)行超濾；

（11）將上述超濾脫鹽的料液加至已用0.05mol/L?NaAC?緩沖液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含0.2?mol/L?NaCl?的緩沖液洗柱，用3倍柱體積的含0.4?mol/L?NaCl?的緩沖液洗脫得洗脫液；

（12）將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，除菌，既得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟（3）中濾液中加入硫酸銨至0.4飽和度，加入硅藻土助濾。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟（7）中用5N?NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0，加入的硫酸為5N的硫酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟（8）中胰蛋白酶加入量為5mg/100g晶體，加入晶體重量1倍的體積的pH?7.6、0.5?mol/L的磷酸鹽緩沖液，以5N?NaOH調(diào)節(jié)pH?7.6。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化工藝，其特征在于步驟（10）中超濾時(shí)添加pH?3.0的冷純化水，至母液電導(dǎo)與0.05mol/L?NaAC?緩沖液電導(dǎo)相同為止。