[發明專利]一種重組枯草芽孢桿菌免疫球蛋白結合蛋白功能域表達載體及其應用

無效

• 申請號: 201210125257.0
• 申請日: 2012-04-26
• 公開（公告）號: CN102676570A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 李志會;孟紅;李鵬;宋楠楠;岳盈盈
• 申請（專利權）人: 山東省醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;A61K39/39;C12R1/125
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種重組枯草芽孢桿菌免疫球蛋白結合蛋白功能域表達載體，其特征在于：載體為大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，其上裝載有免疫球蛋白結合蛋白功能域編碼基因。

2.權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌免疫球蛋白結合蛋白功能域表達載體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)調取載體蛋白基因：

(a)PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調控序列及部分編碼序列；

(b)將上述PCR擴增產物連接pMD-18T載體，測序；

(c)將測序正確的CotB片段雙酶切后連接到相同雙酶切的pDG1662上，得到質粒pDG1662-CotB；

(2)調取目的基因及構建載體：

(a)全序列合成鏈球菌G蛋白C1功能域于載體pUC57上，得到質粒pUC57-C；

(b)PCR方法擴增金黃色葡萄球菌A蛋白A功能域序列；

(c)將上述PCR擴增產物連接pMD-18T載體，測序；

(d)將測序正確的A功能域片段雙酶切后連接到相同雙酶切的質粒pUC57-C上，得到質粒pUC57-AC，雙酶切得到片段AC后連接到相同雙酶切的步驟(1)得到的質粒pDG1662-CotB上，得到質粒pDG1662-CotB-AC，即為重組枯草芽孢桿菌免疫球蛋白結合蛋白功能域表達載體。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)調取載體蛋白基因：

(a)PCR方法擴增枯草芽胞桿菌的CotB基因調控序列及部分編碼序列：

上游引物B1序列為：5’GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct3’；

下游引物B2序列為：5’AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt3’；

位置：兩端酶切位點分別為EcoR?I、HindIII；

擴增條件是：95℃4min，經95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循環擴增30次；

(b)將上述PCR擴增產物連接pMD-18T載體，測序正確后分別用EcoR?I和HindIII雙酶切，電泳回收目的片段后，依次連接到用相同雙酶切的質粒pDG1662上，轉換大腸桿菌DH5α，涂氨芐青霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR及雙酶切鑒定，從而得到質粒pDG1662-CotB；

(2)調取目的基因及構建載體：

(a)全序列合成鏈球菌G蛋白C1功能域于載體pUC57上，兩端分別加入Xho?I、EcoR?I酶切位點，得到質粒pUC57-C；

(b)PCR方法擴增金黃色葡萄球菌A蛋白A功能域序列：

上游引物As序列為：5′-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3′；

下游引Aa序列為：5′-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3′；

位置：兩端酶切位點分別為HindIII、Xho?I；

擴增條件是：95℃4min，經95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循環擴增30次；

(c)將上述PCR擴增產物連接到pMD-18T載體上，測序正確后雙酶切連接到步驟(a)得到的質粒pUC57-C上，得到質粒pUC57-AC，測序正確后用HindIII和BamH?I雙酶切，電泳回收目的片段后，連接到用相同雙酶切的質粒pDG1662-CotB上，得到質粒pDG1662-CotB-AC，轉換大腸桿菌DH5α，涂氯霉素抗性平板選擇陽性克隆，并用菌液PCR及雙酶切鑒定，從而得到質粒pDG1662-CotB-AC，即為重組枯草芽孢桿菌免疫球蛋白結合蛋白功能域表達載體。