[發明專利]多功能磁性熒光微球及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210123475.0
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN102703601A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 羅陽;高維寅;張波;陳鳴;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12N5/09;C09K11/88
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及分子生物學和細胞遺傳學領域，特別涉及多功能磁性熒光微球及其制備方法和應用。

背景技術

磁性納米材料具有超順磁特點，使其取得了廣泛的生物學應用，如可以用于核磁成像，生物靶分子的分離、富集，生物傳感，靶向藥物輸送等各個領域。近年來，開始出現了將磁性納米材料與熒光物質進行組裝，從而形成具有磁性和熒光雙功能的材料，利用磁性納米材料超順磁的特點和熒光物質在紫外激發下發射熒光的特點，從而能夠高分辨的進行可視化藥物靶向的輸送和動態觀測。

磁性納米材料與熒光物質偶聯的方法主要有：1）微球生長法：其是以Fe₃O_4?為核心，然后外面被覆一層熒光納米材料，通過控制表面的被覆來進行雙功能微球的組裝。這種方法的缺點主要是由于Fe₃O₄核心的粒徑太小，從而使得整個超順磁的強度太低，用于生物分離效果太差，不適合進行可視化示蹤。2）混合生長法：其是以SiO₂為核心，表面被覆Fe₃O₄?和量子點的混合物，然后外表面再被覆一層聚合物，從而將磁性納米材料和熒光物質聚合在一個有限的空間內形成一個雙功能微球，該方法通過控制Fe₃O₄?和量子點的混合比例，可以制成不同磁性和不同熒光強度的微球；然而該方法的主要缺點是表面被覆的Fe₃O₄和量子點的比例難以精確控制，從而其發光強度和磁性強度不易準確定量。3）多孔組裝法：該方法采用SiO₂為核心，利用其多孔的結構，從而將Fe₃O₄?和量子點按一定比例進行裝載，使其進入SiO₂的多孔內形成雙功能微球。該方法的最大缺陷是由于SiO₂的孔徑是有限的，這樣就限制了Fe₃O₄和量子點的大小。上述方法構建的具有磁性和熒光雙功能的復合物是利用共價鍵將磁性納米材料和熒光物質共價偶聯，故其結合力較強，因此在進行生物學樣本分離富集后不能將磁性納米材料和熒光物質分離。由于生物學樣本的基質具有復雜性，磁性微球對血液中的各種白蛋白，IgG等具有非特異性吸附，而這些非特異性吸附的蛋白分子會對的熒光檢測造成極大的影響，從而引起假陽性或者假陰性結果的產生。

為了提高檢測靈敏度和特異性，急需一種將生物學樣本分離富集后能夠將磁性納米材料與熒光物質分離的多功能磁性熒光微球。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供多功能磁性熒光微球，檢測靈敏度高和特異性好，富集后可以用限制性內切酶，將磁性納米材料與熒光物質之間的連接切斷，用外加磁場分離去除磁性納米材料，能夠避免因磁性納米材料對檢測樣本中蛋白質和核酸分子的非特異吸附而影響檢測結果。

為實現上述目的，技術方案為：

多功能磁性熒光微球，所述多功能磁性熒光微球包括磁性納米材料、不同發射光譜特征的熒光材料、橋連DNA和標記有淬滅熒光基團的識別不同靶位點的生物探針，所述磁性納米材料和熒光材料通過橋連DNA連接，所述橋連DNA含有限制性內切酶識別位點，所述生物探針偶聯在所述熒光材料表面。

進一步，所述多功能磁性熒光微球是由橋連DNA一端標記的生物素與磁性納米材料表面標記的鏈霉親和素偶聯，所述橋連DNA另一端通過末端標記的氨基與表面修飾有羧基的熒光材料偶聯，所述熒光材料表面修飾的羧基偶聯有至少一種生物探針。

本發明中可以在熒光材料表面同時偶聯多種生物探針，可以在同一檢測體系中同時實現多個靶位點的檢測，加快了檢測速度，同時能夠降低檢測成本。其中熒光材料優選為量子點，最優為CdTe量子點。

本發明中，磁性納米材料優選鐵系氧化物，更優選為四氧化三鐵。

進一步，所述生物探針為分子信標或/和葉酸。

進一步，所述分子信標為識別至少一個靶位點的不同序列的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針一端分別標記有最大發射波長間隔大于30nm的熒光材料，另一端標記淬滅熒光基團。

本發明中可以同時用不同發射光譜特征的熒光材料分別標記生物探針，根據檢測顏色用于判斷檢測結果，為了防止熒光材料之間的相互干擾，選擇最大發射波長間隔大于30nm的熒光材料進行標記，更優選為最大發射波長間隔40nm。