[發(fā)明專利]一種TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的非診斷性方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210122760.0
• 申請(qǐng)日: 2012-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN102827925A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓輝;徐寶梁;李海山;胡群;劉豐;周蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 張飆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的非診斷性方法。?

背景技術(shù)

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio?vulnificus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，廣泛的存在于溫暖的水體環(huán)境中，其在河口、海洋環(huán)境里是較常見的致病菌。主要通過污染海產(chǎn)品和感染傷口而感染健康人畜，創(chuàng)傷弧菌能夠引起敗血癥和傷口感染。近年來有由于食用被創(chuàng)傷弧菌污染的海產(chǎn)品而發(fā)生胃腸炎的相關(guān)報(bào)道，主要癥狀為嘔吐、腹瀉以及腹部疼痛。由創(chuàng)傷弧菌引起傷口感染的病死率高達(dá)50％，由創(chuàng)傷弧菌感染引起敗血癥的病死率高達(dá)75％，尤其是在免疫抑制的病人和體內(nèi)荷鐵量過多的人群中。在腹瀉病監(jiān)測(cè)中，常不能從標(biāo)本中分離到法定傳染病中監(jiān)測(cè)管理的甲類和乙類腸道感染病原菌以及沙門菌等，使得對(duì)病原的確認(rèn)帶來困難，其中一個(gè)原因是缺乏對(duì)其它致腹瀉病原菌的有效檢測(cè)手段，并且，隨著近年海產(chǎn)品食用量的增加、由創(chuàng)傷弧菌引起病例增加以及創(chuàng)傷弧菌感染的高病死率，迅速建立一種能夠快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法顯得至關(guān)重要。?

創(chuàng)傷弧菌的常規(guī)檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)、生化鑒定以及核酸雜交。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)以及熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)。有許多研究介紹了借助常規(guī)PCR和(或)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)能夠作為創(chuàng)傷弧菌生物標(biāo)記的溶血素基因(V.vulnificus?hemolysin?A，vvhA)來鑒定創(chuàng)傷弧菌的方法。如Mark?S.Campbell根據(jù)創(chuàng)傷弧菌溶血素基因(vvhA)建立了基于SYBR?Green的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，但該方法需要借助溶解曲線來區(qū)分特異性擴(kuò)增和非特異性擴(kuò)增，特異性不高。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、?特異性好、靈敏度高的利用TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的非診斷性方法。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的非診斷性方法，該非診斷性方法包括：?

以創(chuàng)傷弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作為靶序列，比對(duì)后選取保守區(qū)域，確定vvhA基因的保守序列：?

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設(shè)計(jì)創(chuàng)傷弧菌實(shí)時(shí)PCR引物和探針：?

進(jìn)一步，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的序列及引物和探針的位置如圖8所示。?

進(jìn)一步，所述探針VVH-P的5’端所標(biāo)記熒光素為FAM，探針3’端連接淬滅基團(tuán)。?

進(jìn)一步，所述該淬滅基團(tuán)為BHQ1非熒光淬滅基團(tuán)。?

進(jìn)一步，所述該非診斷性方法包括步驟：?

1)提取細(xì)菌染色體DNA；?

2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，配制PCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；?

3)將待測(cè)樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增；?

4)在退火階段收集熒光信號(hào)，檢測(cè)Ct值。?

進(jìn)一步，所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下：?

循環(huán)條件：?