[發(fā)明專利]一種快速分離純化小球藻的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210122731.4
• 申請日: 2012-04-25
• 公開（公告）號: CN102643751A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設計）人: 張亞雷;周雪飛;蘇鴻洋;孫振;鐘云娜;閆剛
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速分離純化小球藻的方法。

背景技術

眾所周知，自然生態(tài)系統(tǒng)中的微生物往往是多個種群組成的復雜共生體系，同時，實驗室內小球藻培養(yǎng)過程中也因染菌成為菌藻共生體系。藻種分離和純化是指從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需微藻個體從菌藻共生體系中分離出來，而獲得純種培養(yǎng)，即在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)，這是進行科學研究不可缺少的技術。同樣，利用小球藻進行生理生態(tài)、生物工程、生命科學、醫(yī)學藥物以及環(huán)境污染治理等研究，小球藻的分離純化是必須首先解決的問題。

目前，具體用于微藻分離純化的方法有：樣品系列稀釋分離法、微吸管分離法、水滴分離法和固體培養(yǎng)基分離法。具體介紹如下。

（1）樣品系列稀釋分離法：取一定量混雜有其他生物、含有目標微藻的水樣，用培養(yǎng)液稀釋到每一滴含有一個左右的生物細胞，分別加入到20只裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管，搖勻培養(yǎng)，鏡檢檢查。此法操作簡便，設備簡單，適合于各種藻的分離，特別是從天然水域中初步分離各種藻，但該法盲目性強，要真正達到分離純化的時間長。

（2）微吸管分離法：先制作口徑極細的玻璃微細管，取稀釋適度的藻液水樣置淺凹載玻片上，在顯微鏡下仔細地用微吸管虹吸吸出要分離的藻體，放入另一淺凹載片上，鏡檢是否達到純分離的目的，然后移入經滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，鏡檢檢查。該分離法的特點是易找到特定的種類，所用的設備也較簡單。但操作過程繁瑣，對實驗操作要求很高，往往吸取一個單細胞需要幾次至十幾次才能成功。適于分離個體較大或絲狀的藻類，如螺旋藻、骨條藻等，較小的藻類用此方法很困難。分離時間長，操作過程中還有細菌污染的可能。

（3）水滴分離法：用微吸管吸取經稀釋適度的藻液，間隔一定距離滴到消毒過的載玻片上，顯微鏡下若一個水滴中只有一個藻細胞（無其他生物混雜），即用移液管吸取培養(yǎng)液將水滴沖入裝有滅菌過的培養(yǎng)液試管或小三角瓶中，搖勻培養(yǎng)。此法簡便易行，適宜于分離己在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢藻類，比如分離受少量生物污染的微藻。但操作時同樣要求細致、認真，分離時間長，操作過程中還有細菌污染的可能。

（4）固體培養(yǎng)基分離法（噴霧法、涂布法、劃線法）

固體培養(yǎng)基分離法有噴霧法、涂布法和劃線法等。該類方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。其中，稀釋平板分離法：依次取5個1.5ml滅菌后離心管，每個加入0.9ml滅菌后培養(yǎng)液，吸取0.1ml待分離的藻液加入第一個離心管中，搖均后，再吸取0.1ml藻液倒入第一個平板中，用涂布棒涂抹均勻后，正置放好，再從第一個離心管中吸取0.1ml藻液轉入第二個離心管中，依此操作繼續(xù)進行。涂抹好的平板放置一段時間后放入光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；平板噴霧法：將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中，把藻液均勻噴射在培養(yǎng)基平面上，形成薄層水珠，光照下培養(yǎng)；平板劃線法：將接種環(huán)升入藻液中，然后在平板上劃線，先平行劃線后垂直劃線，再在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。以上方法一般在培養(yǎng)2~3周后，平板上會長出互相隔離的、綠色或者黃色的凸圓形藻類菌落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有經過滅菌的培養(yǎng)液試管或小三角燒瓶中，進行培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基分離法優(yōu)點是操作簡單，適用于絕大部分藻種的分離，且效果最好，很容易得到單一的純種藻類菌落。缺點是工作量十分大，且培養(yǎng)的時間太長，平均1~2個月才有可能得到純種藻類。中途易受污染，特別是存在霉菌生長時，則影響純化分離。適合于分離污染雜菌的微藻，特別是綠藻，但不適合分離喜歡群體生活的藻類細胞。