[發(fā)明專利]一種快速分離純化小球藻的方法無效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210122731.4 | 申請(qǐng)日： | 2012-04-25 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102643751A | 公開（公告）日： | 2012-08-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張亞雷;周雪飛;蘇鴻洋;孫振;鐘云娜;閆剛 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 同濟(jì)大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N1/12 | 分類號(hào)： | C12N1/12;C12R1/89 |
| 代理公司： | 上海正旦專利代理有限公司 31200 | 代理人： | 張磊 |
| 地址： | 200092 *** | 國(guó)省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 分離 純化 小球藻 方法 | ||
1.一種快速分離純化小球藻的方法，其特征在于具體步驟如下：?
（1）制作固體培養(yǎng)基
固體培養(yǎng)基配方：
Ⅰ液：碳源：Glucose·H2O?5000~30000?mg，無機(jī)氮源：尿素?372~2100mg、KNO3?1250~5000?mg或酵母粉3000~11000mg中任一種，無機(jī)鹽：KH2PO4?100~2000?mg,?MgSO4·7H2O?200~2000?mg,?Na2·EDTA?50~500?mg,?H3BO3?11.4~114.2?mg,?CaCl2·2H2O?11.1~111?mg,?FeSO4·7H2O?5.0~49.8?mg,?ZnSO4·7H2O?8.8~88.2?mg,?微量元素：MnCl2·4H2O?1.4~14.2?mg,?MoO3?0.7~7.1?mg,?CuSO4·5H2O?1.6~15.7?mg,?Co(NO3)2·6H2O?0.5~4.9?mg，水500mL，溶液pH值為6.1~9.0；
Ⅱ液：500ml水中加入16~40?g瓊脂，混勻；
固體培養(yǎng)基的制作方法為：分別將Ⅰ液和Ⅱ液經(jīng)121℃、20?min高壓滅菌，在生物超凈工作臺(tái)中紫外滅菌>20?min；當(dāng)滅菌后的Ⅰ液和Ⅱ液冷卻至45~50℃時(shí)，將Ⅰ液和Ⅱ液混勻，傾入無菌平皿，凝固后存放于冰箱內(nèi)備用；
（2）藻種的分離純化
①在水體中采集可能含有目標(biāo)藻種的水樣，并在顯微鏡下觀察藻類及數(shù)目；當(dāng)水樣的顏色為綠色時(shí)，即可判斷微藻為優(yōu)勢(shì)種群，直接分離，當(dāng)微藻數(shù)目不足時(shí)進(jìn)行藻類富集和藻數(shù)目擴(kuò)大培養(yǎng)；
②藻類富集；取40?mL水樣，8000?r/min離心10?min，棄去上清液；補(bǔ)加水樣至?40?mL離心，重復(fù)操作幾次，后用SE培養(yǎng)液懸浮并定容至5?mL，混勻,?經(jīng)篩絹過濾除去大型浮游生物，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)藻類的富集；
③接種藻數(shù)目擴(kuò)大培養(yǎng)：用三角燒瓶作培養(yǎng)容器，加入SE培養(yǎng)液，SE培養(yǎng)液的加入量為三角燒瓶體積的1/4～1/2，以20%?(V/V)以上接種量將富集后的藻類接種到三角燒瓶中，于光照強(qiáng)度2000-4000?lux、光暗比=12:12、溫度?25-28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2周，得到較高濃度的藻液，藻液顏色為綠色；每天應(yīng)至少搖動(dòng)一次藻液；
④接種：取5-10個(gè)1.5ml離心管，依次編號(hào)后分別加入0.9mL?SE培養(yǎng)液，首先取0.1mL經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液搖均加入第一個(gè)離心管中，搖勻后從第一管中取0.1mL藻液加入第二個(gè)離心管中混勻；隨后，依次按10倍的稀釋梯度進(jìn)行同樣操作，以確保藻液稀釋至目標(biāo)微藻濃度為10~100個(gè)/mL；從最后3個(gè)梯度的離心管中取0.1mL藻液涂布接種到步驟(1)所得的固體培養(yǎng)基上；
⑤培養(yǎng)：接種后的平板倒置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時(shí)間為4~5?d，平板上會(huì)長(zhǎng)出綠色或者黃色的藻類菌落，群落會(huì)呈現(xiàn)凸圓形；8~10?d后，藻落直徑則長(zhǎng)到4.8－5.2mm，用接種環(huán)挑取單個(gè)藻類斑點(diǎn)在新平板上進(jìn)行劃線純化，3~4d可從劃線平板通過接種環(huán)轉(zhuǎn)移藻落至三角燒瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)；?
⑥純種檢驗(yàn)：平板培養(yǎng)過程中，在顯微鏡下定期觀察藻落生長(zhǎng)情況；挑取的藻落轉(zhuǎn)移至三角燒瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一天后可吸取樣品于顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)是同一藻種，則基本分離成功；將三角燒瓶中的藻液涂布到裝有適合于細(xì)菌生長(zhǎng)的通用固體培養(yǎng)基的平板上，在28~37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48?h，如無細(xì)菌生長(zhǎng)則表明菌藻分離成功。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于光照培養(yǎng)箱的光強(qiáng)2000-4000?lux、光暗比為12:12、溫度控制在25-28℃。
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