[發明專利]一種Hib多糖與蛋白結合工藝的優化方法

有效

• 申請號: 201210121334.5
• 申請日: 2012-04-23
• 公開（公告）號: CN102633898A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 伍長華;吳強;關曉峰;陳克平
• 申請（專利權）人: 成都歐林生物科技股份有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K39/385;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 成都金英專利代理事務所(普通合伙) 51218
• 代理人: 袁英

技術領域

本發明涉及一種Hib多糖與蛋白結合工藝的優化方法。

背景技術

流感嗜血桿菌(Haemophilus?Influenzae，Hi)迄今為止仍是導致人類侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌(Haemophilus?Influenzae?type?b，Hib)引起。Hib腦膜炎居細菌性腦膜炎的首位，具有發病率高、病死率高和致殘率高等特點，其發病年齡小，嬰幼兒感染率高，發病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。據2006年世界衛生組織報告，全世界每年至少造成300萬例嚴重疾病，其中約38.6萬人死亡，已成為全球性的一大公共衛生問題。在發展中國家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有重要地位，約占所有兒童肺炎的20％，是發展中國家兒童肺炎的重要死亡原因。在亞洲22個國家的48項研究中表明Hib是2/3兒童非結核性腦膜炎的首要致病原因。

接種疫苗是預防絕大多數Hib嚴重病例的唯一公共衛生措施。我國3～5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。因此，我國有使用Hib疫苗的必要。

第一種Hib多糖疫苗于1985年4月在美國上市，這種疫苗適用于2～5歲的兒童。對于小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率實際為零，成為這種疫苗使用上的最大障礙。據流行病學調查表明，6月齡前兒童就需要保護。

結合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題。結合疫苗比以往的疫苗具有更強的免疫原性和更好的免疫效果。結合疫苗于1987年投放市場，主要針對18月齡以上的兒童。在隨后幾年間，三種新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作為結合蛋白。這些新疫苗在嬰幼兒中非常有效。即使在小年齡的嬰兒中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

上世紀90年代初，西歐、美洲等國家將Hib結合疫苗納入常規兒童免疫規劃，Hib侵襲性疾病的發病率迅速降低或消失。目前，世界衛生組織(WHO)正致力于推動將其納入其它國家的計劃免疫程序中。至2004年全球已有包括美洲、歐洲大部分地區和澳洲在內的94個國家將Hib疫苗納入兒童免疫計劃，另有15個國家在全球疫苗與免疫聯盟(GAVI)的資助下使用這種疫苗，占全球所有國家和地區使用量的一半。至2007年，已經有112個國家納入Hib疫苗計劃免疫，3個國家部分納入Hib疫苗。但在人口占世界1/2的亞洲，只有少數幾個國家，如馬來西亞和蒙古(GAVI資助)等將Hib疫苗納入計劃免疫中。中國由于缺乏系統的Hib疾病的流行病學資料，Hib疫苗尚未納入中國計劃免疫的范圍。僅有部分城市開始推廣使用Hib疫苗并獲得了較好的效果。由于疫苗價格較高，在農村和城市中低收入家庭根本沒有能力購買，從而限制了疫苗的普遍使用。

在Hib結合疫苗制備的過程中，Hib莢膜多糖與蛋白載體偶聯是關鍵的步驟。目前普遍運用的結合方法是：用CNBr活化Hib莢膜多糖后連接己二酰肼，然后在碳二亞胺的催化作用下Hib莢膜多糖通過己二酰肼的橋連作用與載體蛋白結合。但該結合方法的合格結合物收率很低，目前業內該結合方法的Hib莢膜多糖收率僅4～6％，因此，為提高合格結合物收率，對結合工藝進行改進是有實際意義的。

發明內容

本發明的目的即在于克服現有技術的不足，提供一種Hib多糖與蛋白結合工藝的優化方法，通過使用癸二酸二酰肼(SDH)作為多糖與載體蛋白結合的新的橋連物，在原來的方法上，通過改變橋連分子，使結合反應更有效地進行，繼而提高多糖與載體蛋白的結合率，縮短結合反應時間，并使結合反應的合格結合物收率得到一定程度提高，結合反應重復性很高，有利于大規模生產，降低了生產成本。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：一種Hib多糖與蛋白結合工藝的優化方法，它包括以下多糖衍化、多糖-TT結合物制備兩個步驟，其中，所述的多糖衍化包括以下子步驟：

S11：在精制Hib莢膜多糖中加入注射用水，稀釋成終濃度為1～2mg/ml的多糖溶液；

S12：加入0.1～0.4倍于多糖質量的CNBr，進行活化處理；

S13：活化完成后，加入3～5倍于多糖質量的SDH，進行偶聯反應；

S14：將偶聯反應所得的反應物分裝于透析袋內，并置于0.02～0.08mol/L的NaCl溶液中透析2～3次，每次透析8～12小時，去除殘余氰化物，然后超濾濃縮至原體積，得到多糖-SDH衍生物；

所述的多糖-TT結合物制備包括以下子步驟：