[發明專利]b型流感嗜血桿菌高密度培養生產細菌莢膜多糖的方法

有效

• 申請號: 201210121314.8
• 申請日: 2012-04-23
• 公開（公告）號: CN102628068A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 李靖;關曉峰;朱沖;魏新;李小兵;楊永華
• 申請（專利權）人: 成都歐林生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12N1/20;C12R1/21
• 代理公司: 成都金英專利代理事務所(普通合伙) 51218
• 代理人: 袁英

技術領域

本發明涉及一種b型流感嗜血桿菌高密度培養生產細菌莢膜多糖的方法。

背景技術

如今，流感嗜血桿菌(Haemophilus?Influenzae，Hi)仍是導致人類侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌(Haemophi?lus?Influenzae?type?b，Hib)引起。Hib腦膜炎的危害居細菌性腦膜炎的首位，具有發病率高、病死率高和致殘率高的特點；其另一個特點是發病年齡小，嬰幼兒感染率高，發病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。據2006年世界衛生組織(WHO)報道，每年全世界Hib腦膜炎至少造成300萬例嚴重疾病，其中約38.6萬人死亡，已成為全球性的一大公共衛生問題。在發展中國家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有很大比例，約占所有兒童肺炎的20％，是發展中國家兒童肺炎的重要死亡原因。在亞洲22個國家的48項研究中，有2/3表明Hib是兒童非結核性腦膜炎的首要致病原。

我國3～5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。因此，我國有使用Hib疫苗的必要。

接種疫苗是預防絕大多數Hib嚴重病例的唯一公共衛生措施。第一種Hib多糖疫苗于1985年4月在美國上市，這種疫苗適用于2～5歲的兒童。流行病學調查表明：6月齡前兒童就需要保護，然而，對于小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率為零，這成為該疫苗使用上的最大障礙和不足。

結合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題，結合疫苗比以往的疫苗具有更強的免疫原性和更好的免疫效果。結合疫苗于1987年投放市場，針對18月齡以上兒童。在隨后幾年間，三種新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作為結合蛋白。這些新疫苗在嬰幼兒中非常有效。即使在小年齡嬰兒中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

上世紀90年代初，西歐、美洲等國家將Hib結合疫苗納入常規兒童免疫規劃，Hib侵襲性疾病的發病率迅速降低，甚至消失。目前，世界衛生組織(WHO)正致力于推動將其納入其它國家的計劃免疫程序中。至2004年，全球已有包括美洲、歐洲大部分地區和澳洲在內的94個國家將Hib疫苗納入兒童免疫計劃，另有15個國家在全球疫苗與免疫聯盟(GAVI)的資助下使用這種疫苗，占全球所有國家和地區使用量的一半。至2007年，已經有112個國家納入Hib疫苗計劃免疫，3個國家部分納入Hib疫苗。但在人口占世界1/2的亞洲，只有少數幾個國家，如馬來西亞和蒙古(GAVI資助)等將Hib疫苗納入了計劃免疫中。我國由于缺乏系統的Hib疾病流行病學資料，Hib疫苗尚未納入中國計劃免疫的范圍。僅有部分城市開始推廣使用Hib疫苗并獲得了較好的效果。在農村和城市中低收入家庭，由于疫苗價格較高，限制了疫苗的普及。

制備Hib結合疫苗首先要獲得Hib莢膜多糖，目前大規模生產Hib莢膜多糖的方法主要是通過發酵罐攪拌及深層通氣的方式培養，當Hib細菌至對數生長期后期或靜止期前期時，使用甲醛殺菌后去除菌體，收集發酵液上清液，再經后續一系列純化工序后獲得高純度的Hib莢膜多糖。傳統生產方式的Hib莢膜多糖產率較低，疫苗生產過程中的成本較高，這也是使Hib疫苗價格居高的其中一個原因。同時，由于Hib發酵液中含有較多的核酸及蛋白等雜質成分，增加了后續純化的難度，為了獲得高純度的Hib莢膜多糖，只能增加純化的工序，更進一步降低了Hib莢膜多糖的收率，使產量進一步下降。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術的不足，提供一種有效降低發酵液中核酸和蛋白等雜質含量、降低去除雜質蛋白所需的苯酚用量的、Hib莢膜多糖產量高的b型流感嗜血桿菌高密度培養生產細菌莢膜多糖的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：b型流感嗜血桿菌高密度培養生產細菌莢膜多糖的方法，它包括以下步驟：

(1)Hib菌種一至四代傳代培養，它包括以下傳代培養步驟：

A、第一代培養：開啟Hib菌種傳代至5～10mlHib液體培養基，放入恒溫搖床振蕩培養16～20h，其中，恒溫搖床振蕩培養的溫度為35～37℃、回旋頻率為250～330rpm；

B、第二代培養：將第一代培養所得的Hib菌種接種到10～20mlHib液體培養基，繼續放入恒溫搖床振蕩培養6～8h，其中，恒溫搖床振蕩培養的溫度為35～37℃、回旋頻率為250～330rpm；