[發(fā)明專利]一種能耐受高濃度丁醇的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210121220.0
• 申請(qǐng)日: 2012-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN102618479A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛紹名;章懷云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南林業(yè)科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/31;C12N15/63;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 長(zhǎng)沙星耀專利事務(wù)所 43205
• 代理人: 寧星耀;許伯嚴(yán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，尤其是涉及一種可用于生產(chǎn)丁醇的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

能源是國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的動(dòng)力。隨著石油資源的大量消耗和價(jià)格的節(jié)節(jié)攀升，能源問題已經(jīng)成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要因素。2011年，我國(guó)原油進(jìn)口依存度高達(dá)55.3%，預(yù)計(jì)到2015年，我國(guó)原油進(jìn)口依存度將超過65.0%。隨著石油資源的耗竭和溫室效應(yīng)等環(huán)境問題的日益突出，高效利用可再生原料生產(chǎn)能源和化學(xué)品已成為全球關(guān)注的重點(diǎn)之一。醇類是一類重要的平臺(tái)化學(xué)品，其中大部分醇可以通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化，因此醇類被認(rèn)為是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锶剂虾蜕锘瘜W(xué)品。

丁醇是一種重要的平臺(tái)化學(xué)品，主要用于制造增塑劑或用作溶劑、萃取劑等；近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)；其含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會(huì)腐蝕管道、不易吸水，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。所以，丁醇已成為一種世界各國(guó)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)強(qiáng)烈關(guān)注的極具潛力的新型生物燃料[Durre,?P.,?Biobutanol:?an?attractive?biofuel.?Biotechnol.?J.?2007,?2,?(12),?1525-34.]。

目前，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇面臨的主要問題是發(fā)酵后期高濃度丁醇對(duì)細(xì)胞的毒性，丁醇毒性是其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)所面臨的最關(guān)鍵的問題[Liu,?S.,?Qureshi,?N.,?How?microbes?tolerate?ethanol?and?butanol.?N?Biotechnol.?2009,?26,?117-121.]。

針對(duì)丁醇毒性問題，國(guó)內(nèi)外研究人員提出了固定化細(xì)胞發(fā)酵、反滲透、全蒸發(fā)、膜蒸發(fā)，液液萃取、吸附及氣提技術(shù)等解決方案，但這些技術(shù)在生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用不可避免的增加了丁醇生產(chǎn)成本，且其本身對(duì)丁醇產(chǎn)量提高程度有限[Ezeji,?T.?C.,?Qureshi,?N.,?Blaschek,?H.?P.,?Bioproduction?of?butanol?from?biomass:?from?genes?to?bioreactors.?Curr.?Opin.?Biotechnol.?2007,?18,?220-227.]。

進(jìn)一步提高生產(chǎn)菌株的丁醇產(chǎn)量，最有效的辦法是提高菌株本身對(duì)丁醇的耐受性，才有可能滿足工業(yè)化需求[Ezeji,?T.,?Milne,?C.,?Price,?N.?D.,?Blaschek,?H.?P.,?Achievements?and?perspectives?to?overcome?the?poor?solvent?resistance?in?acetone?and?butanol-producing?microorganisms.?Appl.?Microbiol.?Biotechnol.?2010,?85,?1697-1712.]。

然而，采用傳統(tǒng)誘變育種方法，已難以大幅度提高菌株對(duì)丁醇的耐受性。主要原因是，基于誘變的隨機(jī)篩選，盲目性大，工作量大，產(chǎn)生的正向突變體頻率低，難以有效地控制變異的方向和性質(zhì)，而且經(jīng)過過去長(zhǎng)期誘變篩選，其提升丁醇耐受性能力的空間已經(jīng)很小[董紅軍,?張延平,?李寅,?丙酮丁醇梭菌的遺傳操作系統(tǒng).?生物工程學(xué)報(bào).?2010,?26,?1372-1378.]。

2001年，丙酮丁醇梭菌基因組的測(cè)序完成，為研究者們對(duì)丁醇生產(chǎn)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)的研究提供了可能?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝網(wǎng)絡(luò)模型等方面都有廣泛的研究報(bào)道。

雖然目前對(duì)丙酮丁醇梭菌生理代謝及調(diào)控的認(rèn)識(shí)已經(jīng)有了很大的進(jìn)步，但是通過菌株改造來提高丁醇耐受性的研究卻進(jìn)展不大，主要原因是缺少有效的靶蛋白進(jìn)行代謝工程的菌株改造。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能耐受高濃度丁醇的梭菌。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種能耐受高濃度丁醇的梭菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是，提供一種利用所述能耐受高濃度丁醇的梭菌生產(chǎn)丁醇的方法。

本發(fā)明解決所述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種能耐受高濃度丁醇的梭菌，通過在梭菌內(nèi)過量表達(dá)htrA基因來提高重組菌對(duì)丁醇的耐受性。

所述htrA基因，其序列為SEQ?ID?NO.1：

atgatggacg?atttaaacaa?taataacgtg?aataataatg?atacagataa?tacaactgaa?60