[發(fā)明專利]一種能耐受高濃度丁醇的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210121220.0
• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN102618479A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛紹名;章懷云
• 申請（專利權(quán)）人: 中南林業(yè)科技大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/63;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 長沙星耀專利事務(wù)所 43205
• 代理人: 寧星耀;許伯嚴(yán)

1.一種能耐受高濃度丁醇的梭菌，其特征在于，含有htrA基因，所述htrA基因的序列為SEQ?ID?NO.1；所述htrA基因編碼的蛋白質(zhì)HtrA的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2。

2.一種如權(quán)利要求1所述能耐受高濃度丁醇的梭菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）pIMPI-Thl質(zhì)粒的構(gòu)建：以丙酮丁醇梭菌C.?acetobutylicum?ATCC?824基因組作為模板，利用PCR擴增141?bp的乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶的啟動子序列，將乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶的啟動子序列經(jīng)Sal?I和BamH?I酶切后與pIMPI質(zhì)粒連接，得到pIMPI-Thl質(zhì)粒；

（2）htrA基因過量表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：以丙酮丁醇梭菌C.?acetobutylicum?ATCC?824基因組作為模板，利用PCR擴增1302?bp的htrA基因，將htrA基因與步驟（1）所得pIMPI-Thl質(zhì)粒進行連接從而構(gòu)建pITHtrA質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.?coli?TOP10(pAN1)中進行甲基化，得到甲基化質(zhì)粒pITHtrA；

（3）htrA基因過量表達(dá)重組菌株的構(gòu)建：厭氧條件下，取60-120mL梭菌強化培養(yǎng)基培養(yǎng)的對數(shù)中后期的丙酮丁醇梭菌C.?acetobutylicum?ATCC?824細(xì)胞液，4℃、3000rmp離心10分鐘，去除上清液，加入60-120mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液，洗滌兩次，并重懸至1.5mL的電轉(zhuǎn)緩沖液中，然后取30-50????????????????????????????????????????????????L轉(zhuǎn)入0.4cm的電轉(zhuǎn)杯中，放置冰浴中用于電轉(zhuǎn)化，加入100-300g步驟（2）所得甲基化質(zhì)粒pITHtrA，置于冰浴中2-3分鐘，采用2000v脈沖電壓和25F的電容進行電轉(zhuǎn)化，隨后將電轉(zhuǎn)液加入到梭菌強化培養(yǎng)基RCM中，37℃培養(yǎng)4-6小時，2000-3000rmp離心10分鐘收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞涂布于含有紅霉素抗性的RCM瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36-40小時后，獲得含有htrA基因過量表達(dá)質(zhì)粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌，命名為酮丁醇梭菌C.?acetobutylicum?ATCC?824(pITHtrA)；

所述梭菌為可產(chǎn)丁醇的梭菌；

（4）重組菌的丁醇耐受性檢測：培養(yǎng)步驟（3）所得含有htrA基因過量表達(dá)質(zhì)粒pITHtrA的丙酮丁醇梭菌重組菌至對數(shù)生長初期OD_600nm=1.0±0.2，厭氧條件下分別分轉(zhuǎn)至含有不同濃度丁醇的培養(yǎng)基中，以含有pIMPI?空質(zhì)粒的梭菌作為對照，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時間測定培養(yǎng)基OD_600nm的變化。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述能耐受高濃度丁醇的梭菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶的啟動子序列為SEQ?ID?NO.3。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的能耐受高濃度丁醇的梭菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述電轉(zhuǎn)緩沖液含270mmol/L蔗糖，5mmol/L?NaH₂PO₄?，pH為?7.4。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的能耐受高濃度丁醇的梭菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述梭菌為產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌（Clostridium?acetobutylicum）或拜氏梭菌（Clostridium?beijerinckii），或Clostridium?saccharoperbutylacetonicum和Clostridium?saccharobutylicum四大類梭菌。

6.一種如權(quán)利要求1所述的能耐受高濃度丁醇的梭菌在生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用。