[發明專利]一種觀賞魚用紅酵母微生態制劑的制備方法

無效

• 申請號: 201210120200.1
• 申請日: 2012-04-24
• 公開（公告）號: CN102715358A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 呂愛軍;胡秀彩;王藝;胡宏曉
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: A23K1/18
• 分類號: A23K1/18;A23K1/16;C12N1/16;C12R1/645
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 高桂珍

技術領域

本發明涉及一種分離與制備微生態制劑的技術，尤其是一種觀賞魚用紅酵母微生態制劑的制備方法。

背景技術

魚類腸道正常菌群是腸道微生物的重要組成成分，是各種生命活動影響因素之一，是在與宿主共同進化過程中形成的，以及二者之間相互作用而成的微生態系，與魚類營養、物質消化吸收、免疫應答、器官的發育及疾病感染有關。腸道菌群跟據其作用可分為固有菌群和非固有菌群，或者分為原籍菌群Autocht?honous?flora和外籍菌群Allocht?honous?flora，這種分類只是相對的。紅酵母?Rhodotorula?廣泛分布于海洋及淡水環境中，其富含蛋白質、不飽和脂肪酸、多種B族維生素、消化酶及生長因子，同時也能產生一些保健功能活性物質。更為重要的是，紅酵母能合成生產以蝦青素為主的類胡蘿卜素，是相當優質的微生物飼料。目前人們把海洋紅酵母Rhodotorula?glutinis作為一種水產養殖的益生菌來應用。紅酵母屬中有許多種類寄附在魚、蝦和貝類的身體上，與其共生，一般不致病，是魚、蝦、貝的開口餌料。斑馬魚Danio?rerio作為一種新型模式生物近年來在研究人類遺傳、免疫、及生理方面倍受關注。利用紅酵母作為觀賞魚和水產品的飼料添加劑，將在防病治病、提高觀賞魚和水產品養殖生產力方面發揮巨大的潛能，并有利于綠色環保型觀賞魚和水產品的生產。

發明內容

為了有效預防觀賞魚及水產品的疾病，減低水產品死亡率，本發明提供一種觀賞魚用紅酵母微生態制劑的制備方法，該方法不僅工藝流程操作簡便，成本低廉，而且本方法制備的觀賞魚的養殖用紅酵母微生態制劑可以起到有效預防觀賞魚和水產品的疾病，增強抗病力的作用，降低病死率，同時不會造成環境污染和抗生素藥物殘留的問題。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：該觀賞魚用紅酵母微生態制劑的分離、鑒定與制備方法包括以下步驟：

（1）紅酵母的分離：

無菌操作對斑馬魚的體表用?75%的酒精消毒，取其腸道中部，置于盛有10mL?的無菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，保持培養基內的溫度為恒溫25-28℃，培養3天；挑選典型菌落轉種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，反復傳代2～3?次，篩選出目的酵母接種到斜面備用；所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基的成分及制備方法為:?去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖?18-20g及瓊脂?13.5-16.5g，由去離子水定容至990-1010?mL，PH值為7-8，115-126℃條件下滅菌18-22min；

（2）紅酵母的鑒定

生理生化實驗

酵母菌生化試劑鑒定管購自杭州天和微生物有限公司，酵母糖發酵和碳源同化的實驗按常規方法進行，保持培養基內為恒溫25-30℃，培養2～5天，觀察結果。

的聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析

提取酵母菌?DNA?后，選取26S?rDNA?D1?/D2?區的PCR?反應體系進行PCR擴增，將擴增產物送由生工生物工程上海有限公司進行測序，采用?BLAST?和Clustalx1.?83?程序進行26S?rDNA?序列比對分析，進而構建系統發育樹和置信度檢測。

（3）紅酵母微生態制劑的制備方法

菌株提取：

取一株（1）中提取的紅酵母菌Rhodotorula?glutinis，保藏號為MCCC2A00030，在PDA培養基上保持恒溫25-30℃培養3天，在發酵培養基中保持恒溫25-30℃、190-210?rpm搖床培養4-6天，該菌26?S?rDNA的GenBank登陸號是HQ323251；所述的發酵培養基為：去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖?18-22g，蛋白胨2.5-3.5g，KH₂PO₄?0.9-1.1g?，MgSO₄0.4-0.6g,由去離子水定容至990?-1010?mL，?PH值為7-8，在115-126℃條件下滅菌18-22min；