[發明專利]一種促進美達霉素生物合成的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210120018.6
• 申請日: 2012-04-23
• 公開（公告）號: CN102660488A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 李愛英;萬娟;王慧利
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/76;C12P17/16;C12R1/465
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域：

本發明涉及的是提高抗腫瘤抗生素美達霉素產量的遺傳育種方法，特別是一種來自納士威爾鏈霉菌的核糖體再循環因子(ribosome?recycling?factor，RRF)的克隆以及用于抗生素美達霉素高產菌育種的方法。此鏈霉菌核糖體再循環因子能夠促進美達霉素的積累，大大提高抗生素的生物合成效率。

背景技術：

鏈霉菌能產生許多有用的抗生素，但多數天然菌株產生抗生素的水平很低，限制了對抗生素的進一步開發，所以抗生素高產菌的育種一直是抗生素產業中的瓶頸。目前抗生素高產菌育種的手段有很多，包括傳統的物化誘變、原生質體融合、分子誘變以及通過代謝工程進行定向遺傳改造等等。

在鏈霉菌體內抗生素的生物合成水平受到多種調控因素的控制，包括多效調節因子(能調控不止一種代謝產物的積累，并且對細胞的分化也有調控作用)、途徑專一性調控基因(調節特定途徑的次生代謝)、體外信號分子等。營養物質對抗生素合成也有調節作用。抗生素合成中的關鍵酶的限速作用、一些輔酶及前體的供應對抗生素的合成效率都有很大影響。因此，抗生素的產生受到多層次的調控【王琳淇等.微生物學報.2009；49(4)：411-416】。

在抗生素高產菌遺傳育種中，最常用的靶點是途徑專一性的調節因子，這些基因位于抗生素生物合成基因簇中，敲除一些負調控因子，或超量表達一些正調控因子都有助于提高抗生素的合成水平。對一些鏈霉菌中特有的多效調節基因的遺傳改造也有助于抗生素高產菌的育種【雷健等.藥物生物技術.2007；14(3)：225-229】。

核糖體再循環因子RRF在細胞中參與蛋白質合成過程，是蛋白質合成中不可缺少的成分。在蛋白質合成結束后，RRF會與翻譯延伸因子一起把核糖體從mRNA上解離下來，參與下一輪蛋白質合成。從三維結構來看，這個RRF蛋白更像是tRNA的結構類似物，所以有科學家認為核糖體從mRNA上解離過程依賴的是RRF的類tRNA結構。后有研究表明在大腸桿菌中RRF主要與50S核糖體亞基作用，推測它與核糖體結合后占據了乙酰化的tRNA結合位點，導致tRNA從核糖體上解離【Yokoyama?T等，EMBO?J.2012；31(7)：1836-1846】。

核糖體再循環因子RRF毋庸置疑決定蛋白質的合成水平，所以RRF成為抗生素遺傳育種的新型靶點【Li?L等，JIndMicrobiol?Biotechnol.2010；37(7)：673-679】，因為抗生素生物合成的一些結構酶的表達也依賴于核糖體再循環因子。

芳香聚酮抗生素美達霉素屬于苯并異色烷醌(benzoisochromanequinones)家族，可由納士威爾鏈霉菌AM-7161(Streptomyces?nashivillensis?AM-7161)產生，具有抗菌和抗腫瘤的生物學活性，可以以一種新穎的機制阻斷多種腫瘤細胞的信號傳導，是一種具有開發潛力的抗癌藥物【Salaski?EJ等，JMed?Chem.2009；2(8)：2181-2184】。

為提高野生菌納士威爾鏈霉菌AM-7161中美達霉素的生物合成水平，本發明旨在從AM-7161中克隆了核糖體再循環因子，并把它構建成高表達質粒，導入美達霉素產生菌中，有效促進了美達霉素的產量。

發明內容：

本發明目的是從苯并異色烷醌類抗腫瘤抗生素美達霉素的野生型產生菌中克隆核糖體再循環因子RRF的編碼基因(frr)，構建這個基因的高效表達質粒，導入美達霉素的產生菌內并實現高效表達，從而促進美達霉素的生物合成。

本發明是這樣實現的：對GenBank中來自其它細胞的核糖體再循環因子的編碼基因(frr)序列進行比對，根據它們的序列保守性設計簡并引物，選擇以美達霉素產生菌納士威爾鏈霉菌AM-7161的基因組為模板，對核糖體再循環因子基因進行PCR擴增。將PCR產物的測序結果進行同源性比對后，將它克隆到鏈霉菌高效表達質粒pIJ8600上，獲得一個核糖體再循環因子高效表達鏈霉菌質粒pHSL56.2。然后通過原生質體轉化，將pHS56.2導入美達霉素產生菌AM-7161中，構建工程菌AM-7161/pHSL56.2。在工程菌AM-7161/pHSL56.2細胞內核糖體再循環因子的高效表達對美達霉素產生水平起到促進作用。

具體步驟為：