[發明專利]桑樹查爾酮異構酶基因及應用

有效

• 申請號: 201210119487.6
• 申請日: 2012-04-23
• 公開（公告）號: CN102643846A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 余茂德;李軍;劉長英;趙愛春;王茜齡;張瓊予;金筱耘;呂蕊花;吳存容
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，特別是涉及桑樹類黃酮化合物生物合成關鍵基因查爾酮異構酶基因及其應用。

背景技術

類黃酮是一類重要的植物次生代謝物質，是由兩個苯環通過中央三碳鏈相互聯結而成的一系列化合物，小部分以游離形式存在，大部分與糖類合成苷類，以配基形式存在。桑樹中類黃酮化合物種類豐富、分布廣泛，主要有花色素、黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類等四大類，藥理研究證明桑樹類黃酮化合物具有良好的抗氧化、降血糖、抗病菌、降血壓、降血脂等功能。類黃酮合成途徑中，查爾酮異構酶基因CHI是極為關鍵的限速酶，控制類黃酮的合成和組分分化，因此桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI可應用于桑樹類黃酮生物合成的調控。

發明內容

本發明的目的之一在于提供桑樹查爾酮異構酶基因核苷酸全序列、桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框ORF序列及3′端非編碼區、桑樹查爾酮異構酶基因編碼的氨基酸序列，以及在此序列基礎上進行密碼子優化或點突變所產生的與原始序列相似度在90%以上的序列。針對桑樹中類黃酮含量較低、提取成本高的困難，提供一個調控桑樹類黃酮生物合成的基因以及在轉基因植物中的應用。

本發明所述的桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI全長的克隆，依次通過以下步驟實現：

1）??根據薔薇科植物草莓或蘋果的查爾酮異構酶基因保守序列設計兼并引物，以桑樹葉片基因組為模板，擴增桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域；

2）??基于獲得的桑樹查爾酮異構酶基因的保守區域設計基因特異引物，采用接頭PCR獲得保守區域的側翼序列；

3）??采用軟件sequencher（http://genecodes.com/）將獲得的側翼序列與保守區域序列進行拼接，采用NCBI網站的blastx程序預測拼接序列中含有的基因開放閱讀框（ORF）及編碼的氨基酸序列；

4）??以桑樹葉片cDNA為模板擴增桑樹查爾酮異構酶基因開放閱讀框（ORF），并連接到pMD19-T?Vector（TaKaRa），挑選陽性克隆并測序。?????

本發明同時提供桑樹查爾酮異構酶基因在桑樹中的應用，即：采用CaMV35S啟動子、35SPolyA以及桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI構建過表達查爾酮異構酶基因的植物表達載體，并采用農桿菌感染桑樹叢生芽的方式獲得轉基因植株，具體步驟如下：

一、植物表達載體的構建：

1）??以pCMBIA2301質粒為模板，采用PCR法分別擴增得到35S啟動子及35SPolyA片段，以桑樹葉片cDNA為模板擴增桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI片段；

2）??將各片段分別插入植物表達載體pCMBIA2301的相應酶切位點中，構建成35S啟動子-CHI-35SPolyA的表達盒，并進行序列測定；

二、桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI的過表達：

1）利用凍融法將植物表達載體轉入農桿菌，采取PCR法鑒定陽性克隆；

2）以桑樹種子為材料進行組織培養獲得叢生芽，構建具有相同遺傳背景的無性繁殖系；

3）采用含植物表達載體的農桿菌感染叢生芽，獲得轉基因植株；

4）根據標記基因的序列設計引物對轉基因苗子進行PCR檢測；

5）以槲皮素為標準品，采用高效液相色譜（HPLC）技術檢測轉基因苗與對照組類黃酮含量的變化。

上述基因側翼序列的克隆中，接頭PCR為依賴于銜接頭的側翼序列分析方法。上述植物表達載體的構建中，CaMV35S啟動子是花椰菜花葉病毒啟動子，一種強啟動子，被廣泛應用于轉基因植物中進行過量表達。35SPolyA為35S的終止序列。載體pCMBIA2301是目前常用的植物雙元表達載體，含卡那的抗性以及Gus標記基因。

桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI的應用，將該基因應用于真核及原核表達。

桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI應用于過量表達提高桑樹類黃酮的含量。

桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI應用于抑制查爾酮異構酶基因的表達獲得新的轉基因株系。

桑樹查爾酮異構酶基因MaCHI應用于其他植物品種的轉基因。

附圖說明

圖1為MaCHI保守區域PCR電泳圖。M：Trans2000；1：MaCHI保守區域片段擴增