[發明專利]PGENE基因以及在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法

有效

• 申請號: 201210118900.7
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN102676546A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 趙凌俠;楊桂華;王曉磊;李善爽;高美鳳;高蕾;趙攀峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/63;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及一種基因工程領域人工合成的病毒基因以及在植物中表達功能蛋白的方法，具體涉及一種諾如病毒P粒子的PGENE基因以及在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法。

背景技術

諾如病毒(Norovirus，簡稱NVs)是導致人類非細菌性急性胃、腸炎的主要病原；該病毒可以感染各年齡段人群，嬰幼兒、老年人和免疫系統缺陷病人屬于易感人群；該病全年均可發生，冬季屬于高發期(MountsAW，etal傳染病學2000，181(2)：284-287)；感染力僅次于輪狀病毒(BogaJA，etal微生物診斷2004，42(6)：2668-2674)。NVs屬于正義單鏈RNA病毒(GreenKY，etal傳染病學，2000，181(2)：S322-330)，NVs基因組易發生變異，導致其抗原性改變，毒株進化較快，因而疫情難以控制。疫苗是臨床防治NVs疫情爆發主要手段之一，NVs衣殼蛋白的亞基疫苗是NVs疫苗研究熱點之一。實驗證實(XiaM，etal醫學雜志2007，79(1)：74-83)，小鼠通過肌肉注射或喂飼酵母源的VA387的VLPs可以產生免疫應答，未經純化的酵母提取物在沒有佐劑情況下也可誘導小鼠產生免疫反應；用昆蟲表達諾如病毒VLPs用于注射小鼠時，同樣能引起小鼠的免疫應答。

目前，對NVs疫苗研究僅局限于病毒樣顆粒(virus-like?particles，VLPs)，而用NVs衣殼蛋白P粒子作為亞基疫苗，特別是用植物系統生產NVs衣殼蛋白P粒子疫苗尚未見報道。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術中的不足，按植物偏愛密碼子設計合成諾如病毒P粒子基因并提供一種在轉基因番茄果實中生產口服NVs衣殼蛋白P粒子疫苗的方法，通過食用轉基因番茄果實達到預防諾如病毒的感染，本產品在廣泛預防Norovirus病毒感染和生產預防和治療疫苗方面彌補了細菌、酵母和昆蟲等表達病毒樣顆粒的局限性，具有重要應用和理論價值。

本發明通過以下技術方案實現：

一種諾如病毒P粒子的PGENE基因，是按照植物偏愛子密碼設計合成的核苷酸序列，將該基因置于番茄果實特異表達啟動子E8基因下游，并在其5′端添加編碼6×His-tag核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一種表達載體，該表達載體包括如SEQIDNO.1所示的堿基序列。

一種在番茄中表達PGENE功能蛋白的方法，該方法包括如下步驟：

步驟一，PGENE基因表達載體的構建，所述構建的具體過程如下：

(1)、用SpeI和BstEII雙酶切含有PGENE基因的載體pUC57-PGENE，回收目標DNA片段，獲得帶有相應粘性末端的目的基因PGENE，同時利用SpeI和BstEII雙酶切載體p2302-gfp(該載體骨架為pCAMBIA2301)，回收大片段，然后將兩個所述片段連接并轉化大腸桿菌DH5α，得到中間載體p2302-PGENE；

(2)、用KpnI和SpeI雙酶切中間載體p2302-PGENE，并用相同的酶切含有番茄果實特異性表達E8啟動子全長的載體pMD18T-E8full2，回收目的DNA片段；

(3)、將回收的所述目的DNA片段連接構成表達載體質粒，用PCR和測序兩種方法鑒定所述表達載體質粒，在確認所述表達載體質粒中目的基因閱讀框架正確無誤前提下，將所述表達載體質粒用凍融法導入農桿菌中，獲得包含PGENE基因表達載體質粒的農桿菌；

步驟二、所述包含PGENE基因表達載體質粒的農桿菌轉化番茄，所述轉化的具體過程如下：

(1)將表面消毒的黃櫻桃番茄22號(Solanum?lycopersicum?var.cerasiforme?yellow?cherry?No.22)種子播于MS發苗培養基上，取其小苗的下胚軸和子葉作為外植體進行遺傳轉化；

(2)將所述包含PGENE基因表達載體的農桿菌于28℃搖菌培養至OD₆₀₀＝0.8～1.0時，室溫6000rpm離心5分鐘；

(3)棄上清，菌體用MS液體培養基重懸，然后加入無菌外植體浸泡6分鐘；

(4)取出轉化后的外植體，置于共培養基上，在25℃暗黑條件下共培養36小時；

(5)共培養結束后將所述外植體轉移到愈傷組織誘導培養基上，在25～28℃光照下培養，光周期為光照16h和黑暗8h，培養至愈傷組織形成，然后轉到分化培養基上培養至有再生芽從所述外植體切口處長出；