[發明專利]PGENE基因以及在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法

有效

• 申請號: 201210118900.7
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN102676546A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 趙凌俠;楊桂華;王曉磊;李善爽;高美鳳;高蕾;趙攀峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/63;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種諾如病毒P粒子PGENE基因，其堿基序列如SEQIDNO.1所示。

2.一種表達載體，其特征在于，該表達載體包括如SEQIDNO.1所示的堿基序列。

3.一種在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一，PGENE基因表達載體的構建，所述構建的具體過程如下：

(1)、用SpeI和BstEII雙酶切含有PGENE基因的載體pUC57-PGENE，回收目標DNA片段，獲得帶有相應粘性末端的目的基因PGENE，同時利用SpeI和BstEII雙酶切載體p2302-gfp，回收大片段，然后將兩個所述片段連接并轉化大腸桿菌DH5α，得到中間載體p2302-PGENE；

(2)、用KpnI和SpeI雙酶切中間載體p2302-PGENE，并用相同的酶切含有番茄果實特異性表達E8啟動子全長的載體pMD18T-E8full2，回收目的DNA片段；

(3)、將回收的所述目的DNA片段連接構成表達載體質粒，用PCR和測序兩種方法鑒定所述表達載體質粒，在確認所述表達載體質粒中目的基因閱讀框架正確無誤前提下，將所述表達載體質粒用凍融法導入農桿菌中，獲得包含PGENE基因表達載體質粒的農桿菌；

步驟二、所述包含PGENE基因表達載體質粒的農桿菌轉化番茄，所述轉化的具體過程如下：

(1)將表面消毒的黃櫻桃番茄22號種子播于MS發苗培養基上，取其小苗的下胚軸和子葉作為外植體進行遺傳轉化；

(2)將所述包含PGENE基因表達載體的農桿菌于28℃搖菌培養至OD600＝0.8～1.0時，室溫6000rpm離心5分鐘；

(3)棄上清，菌體用MS液體培養基重懸，然后加入無菌外植體浸泡6分鐘；

(4)取出轉化后的外植體，置于共培養基上，在25℃暗黑條件下共培養36小時；

(5)共培養結束后將所述外植體轉移到愈傷組織誘導培養基上，在25～28℃光照下培養，光周期為光照16h和黑暗8h，培養至愈傷組織形成，然后轉到分化培養基上培養至有再生芽從所述外植體切口處長出；

(6)待所述再生芽長至3～4cm時，用滅菌切片切下所述再生芽并移植到生根培養基上進行生根培養；

(7)完整根系形成后，將該再生植株取出，并清洗去除附著在根系上的固體培養基，移植到珍珠巖中馴化，同時用重量體積比為1％的MS粉水溶液補充營養和水分，然后將所述植株移入土中繼續生長。

4.根據權利要求3所述的在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，該方法還包括轉基因番茄外源基因整合和轉錄后RNA的檢測以及PGENE功能蛋白的提取。

5.根據權利要求3或4所述的在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，所述發苗培養基的組分和各組分的質量百分比為：MS粉為0.22％，蔗糖為3％，植物凝膠為0.26％，余量為ddH₂O；該發苗培養基的pH值為5.8。

6.根據權利要求3或4所述的在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，所述MS液體培養基的組分和各組分的質量百分比為：MS粉為0.44％，蔗糖為3％，余量為ddH₂O；該MS液體培養基的pH值為5.8。

7.根據權利要求3或4所述的在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，所述共培養培養基的組分和各組分的質量百分比為：MS粉為0.44％，蔗糖為3％，植物凝膠為0.26％，6-芐氨基嘌呤為0.0001％，α-萘乙酸為0.00001％，余量為ddH₂O；該共培養培養基的pH值為5.8。

8.根據權利要求3或4所述的在番茄系統中表達PGENE功能蛋白的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導培養基的組分和各組分的質量百分比為：MS粉為0.44％，蔗糖為3％，植物凝膠為0.26％，6-芐氨基嘌呤為0.0001％，吲哚-3-乙酸為0.00002％，α-萘乙酸為0.00001％，余量為ddH₂O；該共培養培養基的pH值為5.8。