[發明專利]在牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法

有效

• 申請號: 201210118796.1
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN103374564A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 郭宏;李光鵬;葛秀國;丁向彬;劉新峰;李吉霞
• 申請（專利權）人: 天津農學院;內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于生物技術領域中的基因工程技術，涉及一種通過基因打靶技術在牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法。?

背景技術

二脂酰甘油酰基轉移酶1(diacylgycerol?acyltransferasel，DGAT1)存在于動植物和細菌、真菌等生物體內，是一種完整的細胞膜酶，以甘油二酯和脂酰輔酶A為底物，催化甘油三酸酯合成反應，也是甘油三酸脂合成過程中的唯一的關鍵酶。此外，DGAT1還參與腸道中脂肪吸收、脂蛋白的組裝、血漿中甘油三脂濃度的調節、脂肪細胞中脂肪的儲存、肌肉中能量代謝以及乳脂的合成、禽蛋以及卵母細胞的形成，因此是機體中一種非常重要的酶。?

牛的DGAT1基因位于14號染色體19cM處，與微衛星CSSM66緊密連鎖。牛DGAT1基因全長為8.6kb，由17個外顯子和16個內含子組成，外顯子的平均長度為121.8bp(42～436bp)，第1、2內含子的長度分別為3.6、1.9kb，其余內含子的平均長度為92.4bp(70～215bp)(GenBank登錄號：AJ318490)。牛DGAT1基因轉錄的mRNA由245bp?5’UTR序列、1470bp編碼區(489個氨基酸)、275bp?3’UTR序列(包含1個典型的AATAAA聚腺苷酸化信號)組成。?

DGAT1在生物體中有許多功能，與體脂、產奶性狀等存在一定相關性。DGAT1與豬4號染色體上一個影響體脂含量的QTL相連鎖。在牛14號染色體檢測到肉牛背膘厚度的一個QTL。DGAT1基因對牛的皮下脂肪有加性效應。DGAT1基因17外顯子和3’UTR基因座位對肉牛宰前體重、胴體重、凈肉重、眼肌面積、背膘厚度、體長、膘度和胴體長的影響差異顯著。研究結果發現牛的DGAT1基因遺傳多態性對乳成分及產奶量有重大影響，K232A取代后可以增加乳脂率，但降低乳蛋白率和產奶量。DGAT1基因3’UTR處基因型與中國荷斯坦奶牛的乳蛋白率和乳脂率有極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)的相關性，5’UTR處基因型與乳脂率有顯著的相關性(P＜0.05)。?

研究發現，牛DGAT1基因外顯子8存在一處由AA到GC的雙核苷酸突變，其導致第232位的賴氨酸突變為丙氨酸，命名為K232A。比對氨基酸序列表明，牛DGAT1第232位的氨基酸在其他物種上是保守的，而且小鼠、大鼠、人等均為賴氨酸，對牦牛(2個體)、水牛(2個體)和瘤牛(16個體)的分析發現，它們在該位點均為賴氨酸。說明牛DGAT1肽鏈中第232個氨基酸殘基的保守氨基酸是賴氨酸殘基。可以推斷，不同品種普通牛群體中都存在DGAT1K232A取代。K232A與產肉性狀有一定的相關性。DGAT1基因K232A與德國荷斯坦牛和夏洛萊牛半肌腱和背最長肌中的肌內脂肪有顯著的關聯性。DGAT1基因K232A取代對乳成份及產奶量也有重大影響。等位基因K與乳脂率、乳脂量、乳蛋白率的升高相關，?與乳蛋白量、產奶量的下降相關。DGAT1基因已成為基因操縱的主要目標，通過轉基因改變牛奶的組成以適應市場需求。?

發明內容

鑒于DGAT1基因K232A取代對產肉性狀和產奶性狀的影響，本發明的目的在于提供一種通過基因打靶技術在牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法，以提高牛肉及牛乳的品質。?

本發明的技術方案概述如下：?

一種牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法，包括以下步驟：?

(1)帶有K232A突變的牛DGAT1基因同源短臂的構建?

①以SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2為上、下游引物，以牛基因組為模板，PCR擴增，得到1.8kb的5’端引入了一個Nsi?I酶切位點，3’端引入了一個Pme?I酶切位點的DGAT1基因同源短臂S，將所述DGAT1基因同源短臂S插入T載體得到質粒pTS；所述DGAT1基因同源短臂S包括部分內含子6，外顯子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，內含子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16及部分外顯子17；?

②以含突變位點的引物SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4為上、下游引物，以所述pTS為模板，用高保真酶Pyrobest擴增，將所述DGAT1基因同源短臂S的K232A位點的堿基AA突變為GC；用酶Dpn?I處理擴增產物去除模板質粒DNA，酶切產物純化后轉化大腸桿菌DH5α并篩選陽性克隆，經測序鑒定為突變成功，得到載體pTSM；?

(2)牛DGAT1基因同源長臂的構建?