[發明專利]在牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法

有效

• 申請號: 201210118796.1
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN103374564A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 郭宏;李光鵬;葛秀國;丁向彬;劉新峰;李吉霞
• 申請（專利權）人: 天津農學院;內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種牛DGAT1基因中引入K232A精細突變的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)帶有K232A突變的牛DGAT1基因同源短臂的構建

①以SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2為上、下游引物，以牛基因組為模板，PCR擴增，得到1.8kb的5’端引入了一個Nsi?I酶切位點，3’端引入了一個Pme?I酶切位點的DGAT1基因同源短臂S，將所述DGAT1基因同源短臂S插入T載體得到質粒pTS；所述DGAT1基因同源短臂S包括部分內含子6，外顯子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，內含子7、8、9、10、11、12、13、14、15、16及部分外顯子17；

②以含突變位點的引物SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4為上、下游引物，以所述pTS為模板，用高保真酶Pyrobest擴增，將所述DGAT1基因同源短臂S的K232A位點的堿基AA突變為GC；用酶Dpn?I處理擴增產物去除模板質粒DNA，酶切產物純化后轉化大腸桿菌DH5α并篩選陽性克隆，經測序鑒定為突變成功，得到載體pTSM；

(2)牛DGAT1基因同源長臂的構建

以SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.6為上、下游引物，以牛基因組為模板，擴增，得到5.5kb的5’端引入了一個Pac?I酶切位點，3’端引入了一個Not?I酶切位點的DGAT1基因的同源長臂L；所述同源長臂L包括部分內含子1，外顯子2、3、4、5、6，內含子2、3、4、5及部分內含子6；

(3)打靶載體的構建

①用Pac?I和Not?I雙酶切所述同源長臂L及pFPC-1載體，連接，使所述同源長臂L插入質粒載體pFPC-1的Pac?I和Not?I酶切位點，得到載體pL，轉化大腸桿菌DH5α；

②用Nsi?I和Pme?I雙酶切所述步驟(1)獲得的載體pTSM，回收1.8kb突變后的同源短臂片段，連接到Nsi?I和Pme?I酶切后的pL載體上，得到打靶載體pLSM；

(4)K232A精細突變的引入

①用Pac?I或Pme?I單酶切處理所述打靶載體pLSM使其線性化，按照脂質體轉染試劑說明書轉染牛體細胞，同源重組后使篩選標記基因Neo-TK及K232A突變點引入牛DGAT1基因第8外顯子，用G418和DTA特性對成功進行同源重組的細胞株進行篩選；

②用含有重組酶Cre基因的腺病毒載體轉染293細胞進行病毒包裝，收集腺病毒，感染步驟①成功同源重組后的細胞株，用Cre酶的活性刪除loxp位點當中的篩選基因Neo-TK，用GANC篩選出成功刪除Neo-TK后的細胞株；在牛DGAT1基因中引入了K232A精細突變。