[發明專利]一種對抗體具有廣譜吸附能力的融合蛋白制備方法及應用

有效

• 申請號: 201210118134.4
• 申請日: 2012-04-21
• 公開（公告）號: CN102676562A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 賈凌云;張嘉玉;任軍;徐麗;謝健
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18;B01J20/26;B01D15/08;C12R1/19
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種對抗體具有廣譜吸附能力的融合蛋白AG的制備方法及其在抗體純化和血液凈化等領域中的應用。?

背景技術

自身免疫性疾病(Autoimmune?diseases，AID)是在特定情況下，機體自身耐受機制遭到破壞，免疫系統將自身的物質錯誤地識別為外來有害物質，致使自身抗體和自身反應性T淋巴細胞識別并損害機體自身正常細胞、組織、器官，從而導致一系列病變。由于自身抗體和免疫復合物在自身免疫性疾病中的致病性已被證實，通過吸附劑體外清除的方式降低病人血液中自身抗體和免疫復合物的濃度能夠明顯改善癥狀，對疾病可以起到緩解和治療作用，在臨床中已得到廣泛應用。?

蛋白A免疫吸附柱是目前在自身免疫性疾病治療中用量最大、治療效果最好的吸附柱。?和?是兩種最常用的蛋白A類免疫吸附柱，二者均獲得了美國食品藥品管理局(FDA)認證，廣泛用于治療免疫球蛋白相關疾病。?

蛋白A免疫吸附柱的關鍵成分是功能基蛋白A。蛋白A(Staphylococcus?aureus?proteinA，SPA)是金黃色葡萄球菌細胞壁的組分，占整個細胞壁蛋白的6.7%，以共價鍵的形式與胞壁肽聚糖相結合，分子量為42kDa，等電點pH?5.1，易被同位素碘所標記，對熱和變性因子穩定，其分子含4個酪氨酸殘基，無色氨酸。不含有半胱氨酸，所以分子中不含有二硫鍵。蛋白A分為三個部分：信號肽序列（S），五個高度同源的IgG結合結構域(E、D、A、B、C)以及錨定蛋白結構域（X）。蛋白A能與人及多種哺乳動物血清IgG中的Fc片段結合，但親和性各不相同，具有種系選擇性。此外，其還能與血清中少量的IgM和IgA結合。同時，蛋白A與人不同類型免疫球蛋白的結合能力也不同，其對IgG的結合率為95%(IgG₁100%，IgG₂100%，IgG₄100%，IgG₃35%)，IgM?51%，IgA?14%，IgE?7%。ProteinA的結構域示意圖（如圖6）?

然而蛋白A免疫吸附劑在30年的臨床應用中也存在一些弊端，譬如其與人IgG₃結合力較弱，對于一些致病抗體包含IgG₃的疾病如系統性紅斑狼瘡、擴張性心肌炎等疾病效果不顯著。為了克服蛋白A吸附劑的上述缺陷，本發明將一段與人IgG₃具有較強結合能力的蛋白G?的基因與蛋白A的抗體結合結構域基因相連接，實現AG融合蛋白的重組表達，進而制備的融合蛋白AG吸附劑將彌補蛋白A吸附劑對IgG₃結合力弱的不足，提高其對系統性紅斑狼瘡、擴張性心肌炎等疾病的治療效果。?

鏈球菌蛋白G（Streptococcus?protein?G，SPG）是一種存在于A、C、G群鏈球菌的細胞壁的蛋白，完整的蛋白分子量為64~65kDa，對熱比較穩定，分子結構中沒有二硫鍵，呈長纖維狀。蛋白G分子中包含兩至三個序列高度同源的免疫球蛋白結合域（C1、C2、C3），位于分子的C末端，其單結構域由兩對反向平行的β片層和中間的一個α螺旋組成。其分子中還包含有信號肽（S）、白蛋白結合結構域(A、B)以及細胞壁錨定蛋白結構域（W、M）。蛋白G具有與人和哺乳動物IgG結合的能力，與人IgG的4個亞類均具有較強結合能力，包括IgG₃，但不與IgA、IgM、IgD和IgE結合。研究表明，完整的蛋白G分子可與人IgG的Fc片段以及Fab片段同時結合，還可與人血清白蛋白結合。蛋白G已廣泛用作免疫學試劑，主要應用于免疫學探針以及IgG的純化。Protein?G的結構域示意圖（如圖7）?

可以看出，蛋白A與蛋白G在功能上具有互補性，兩者的融合蛋白具有更好的結合特性，既可以彌補蛋白A對于IgG₃結合力弱的不足，又可以彌補蛋白G不結合其它類型免疫球蛋白的不足，是更為理想的免疫球蛋白結合蛋白。融合蛋白AG結構示意圖（如圖8）?