[發(fā)明專利]一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210116912.6
• 申請日: 2012-04-20
• 公開（公告）號: CN102634566A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝志浩;屠燕萍;俞泓伶
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/32;C12Q1/48;G01N21/31
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及消化酶活力的測定，具體涉及一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法。

背景技術(shù)

橈足類動(dòng)物是一類小型低等甲殼動(dòng)物，是海洋浮游動(dòng)物的重要組成部分。它既是浮游植物的攝食者，又是魚類的餌料基礎(chǔ)，在海洋食物鏈、次級生產(chǎn)力和能量流動(dòng)中占有關(guān)鍵性位置。橈足類動(dòng)物的研究中經(jīng)常涉及到橈足類動(dòng)物攝食消化能力、對周圍環(huán)境食物濃度適應(yīng)能力和營養(yǎng)狀況等的分析，消化酶活力是反映橈足類動(dòng)物對餌料等營養(yǎng)物質(zhì)利用能力的重要指標(biāo)，由于橈足類動(dòng)物體形微小，對環(huán)境因子影響較為敏感，所以消化酶活力也可以作為指示環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)之一；這就需要通過測定橈足類動(dòng)物的消化酶活力來加以判斷。傳統(tǒng)分析消化酶活力的方法，由于需要樣品量較大，操作復(fù)雜，測試周期較長，所以誤差較大，這對于個(gè)體小，室內(nèi)難以大量長期培養(yǎng)的橈足類動(dòng)物來說，造成測試?yán)щy，所以建立獨(dú)立的橈足類動(dòng)物的消化酶活力的測定方法尤其重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，該方法操作簡便，樣品量少，測試時(shí)間短，測試效率高。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，其步驟如下：

a、將5-15只橈足類動(dòng)物置于研缽中，加入濃度為1mM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液（Tris-HCl）500μl，冰浴研磨成勻漿液，在15000?rpm、0-4℃下，冷凍離心機(jī)離心10min，取上清液待用；

b、將1mg纖維二糖加入到1毫升濃度為100mM的醋酸溶液中，加熱溶解得到纖維二糖醋酸液，取上述上清液80μl與420μl纖維二糖醋酸液混勻，在20℃水浴溫育2h，然后在95℃水浴2min，終止反應(yīng)得到水浴產(chǎn)物；

c、取上述水浴產(chǎn)物40μl，與1ml濃度為50mM?的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，0.5ml濃度為1mM的MgCl₂液，0.5ml濃度為0.5mM的二硫蘇糖醇液，1ml濃度為1μg?/ml的己糖激酶液，1ml濃度為30μM的氧化型輔酶Ⅱ液(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，NADP⁺)，1ml濃度為300μM的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)液，1ml濃度為0.02U/ml的?6-磷酸葡萄糖脫氫酶液混合，攪拌均勻，酶促反應(yīng)10min，得到含還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的酶促產(chǎn)物；

d、用移液器吸取上述酶促產(chǎn)物置于熒光分光光度計(jì)中，在激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為450nm下測量還原型輔酶Ⅱ的吸光值，根據(jù)公式0.2737×吸光值?-?0.4518計(jì)算得到還原型輔酶Ⅱ的總濃度(μg?ml^-1)；

e、根據(jù)下述公式計(jì)算樣品中每只浮游動(dòng)物的纖維二糖酶活力，纖維二糖酶活力(μg?glucose·ind^-1·h^-1)?=?A×6÷833.35×180×500÷80×500÷40÷2÷B，公式中A為還原型輔酶Ⅱ的總濃度，B為橈足類動(dòng)物的只數(shù)。式中833.35為NADPH的分子量，180為葡萄糖的分子量，6為酶促反應(yīng)試劑的體積，?500÷80為500μl勻漿液取80μl上清液，500÷40為500μl水浴反應(yīng)中取40μl水浴產(chǎn)物，2為20℃溫育時(shí)間。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種橈足類中纖維二糖酶活力的測定方法，對5-15只橈足類動(dòng)物在緩沖液下研磨、離心，再與底物纖維二糖水浴反應(yīng)得到水浴產(chǎn)物，然后水浴產(chǎn)物與Tris-HCl、MgCl₂、二硫蘇糖醇、己糖激酶、NADP⁺、ATP、6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合進(jìn)行酶促反應(yīng)，再以酶促產(chǎn)物中還原型輔酶Ⅱ的吸光值和浮游動(dòng)物只數(shù)為參數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算得到每只橈足類動(dòng)物中纖維二糖酶的活力；本發(fā)明的方法只要幾只到十幾只橈足類動(dòng)物就可完成消化酶活力的測定，解決了由于橈足類個(gè)體小，室內(nèi)難以大量長期培養(yǎng)，很難獲得用于酶活力測定樣品量的這一問題，只是對橈足類動(dòng)物中纖維二糖酶進(jìn)行水浴和酶促二步反應(yīng)就可以得出還原型輔酶Ⅱ的吸光值，操作簡便，反應(yīng)時(shí)間短，誤差也較少，因此本發(fā)明具有操作簡便，樣品量少，測試時(shí)間短，測試效率高的優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1