[發明專利]一種檢測金黃色葡萄球菌的方法

無效

• 申請號: 201210116297.9
• 申請日: 2012-04-19
• 公開（公告）號: CN102645536A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 牛凱莉;支援;徐寬;沈鶴柏
• 申請（專利權）人: 沈鶴柏
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種檢測金黃色葡萄球菌的方法，步驟包括：使包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子與待測樣品混合，形成抗體-磁性粒子-金黃色葡萄球菌的復合物；在外加磁場吸引作用下，收集所述的復合物；將所述的復合物接種到培養基中進行6-12小時的培養；用金黃色葡萄球菌膠體金免疫層析試紙進行定性或定量檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子為以Fe₃O₄納米粒子為內核，以SiO₂為外殼，表面標記金黃色葡萄球菌特異性抗體的磁性納米粒子。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子是采用如下方法制備的，步驟包括：

(a)將包裹SiO₂的Fe₃O₄磁性納米粒子分散在有機溶劑中，加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷，混合反應，制成表面氨基化的超順磁性納米粒子；其中，N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷與包裹SiO₂的Fe₃O₄磁性納米粒子比例為0.06mL到0.12mL比1mg納米粒子；

(b)將表面氨基化的磁性納米粒子分散于含質量濃度為1％～2％戊二醛的磷酸緩沖液中，將金黃色葡萄球菌特異性抗體與步驟(a)所得表面氨基化的磁性納米粒子偶聯，得到包被有金黃色葡萄球菌特異性抗體的超順磁納米粒子；其中，所述的磷酸緩沖液的pH＝7.4。

4.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的特異性抗體為抗金黃色葡萄球菌的多克隆抗體或單克隆抗體。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體的質量比為1∶0.005～0.05。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性納米粒子與抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體的質量比為1∶0.003～0.03。

7.一種用于權利要求1所述方法的膠體金免疫層析試紙，包括：涂布有膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復合物的結合墊；和沿層析方向依次噴涂有金黃色葡萄球菌單克隆抗體的檢測線、噴涂有羊抗兔IGg抗體的質控線的分析膜；其中，按權利要求1的方法進行檢測，所述膠體金免疫層析試紙的檢測時靈敏度為10⁴cfu/mL菌液。

8.根據權利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的試紙還包括PVC底板、樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊，且沿層析方向的疊放順序依次為底板、樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊。

9.根據權利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的膠體金平均粒徑范圍為10-80nm。

10.根據權利要求7所述的膠體金免疫層析試紙，其特征在于，所述的膠體金免疫層析試紙是以如下方法制備的，步驟包括：

a)、制備膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復合物：采用兩次離心的方法將膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體包被于10-80nm粒徑的膠體金表面，13000r/min離心，并用硼酸緩沖溶液離心洗滌，濃縮至原體積的1/50-1/2，4℃冷藏保存；

b)、制備樣品墊：將玻璃纖維膜浸入含有BSA和表面活性劑吐溫20的PBS緩沖溶液中，取出在網孔平板上于30-45℃晾干備用；

c)、制備結合墊：將a)步驟中制備的膠體金標記的金黃色葡萄球菌單克隆抗體復合物分散于含BSA和PBS的緩沖溶液中，并均勻涂布在剪切好的玻璃纖維素膜上，在網孔平板上于30-45℃晾干備用；

d)、制備分析膜：將金黃色葡萄球菌單克隆抗體和羊抗鼠IgG(二抗)定點涂布在分析膜的不同位置，分別作為檢測線和質控線，于30-45℃晾干備用；

e)、組裝膠體金免疫層析試紙：將吸水墊和步驟b)～d)所制備的結合墊、樣品墊、分析膜依照沿層析方向依次為底板、樣品墊、結合墊、分析膜、吸水墊的順序疊放，貼在PVC底板上，并切成試紙形狀。