[發(fā)明專利]一種檢測金黃色葡萄球菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210116297.9
• 申請日: 2012-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN102645536A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牛凱莉;支援;徐寬;沈鶴柏
• 申請（專利權(quán)）人: 沈鶴柏
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種快速富集、篩選、定性及定量檢測金黃色葡萄球菌的方法及其專用試紙。

背景技術(shù)

民以食為天，食品是人類賴以生存和發(fā)展的最基本的物質(zhì)條件，但是全球及我國接連不斷發(fā)生的食源性病原微生物引起的食品安全事故和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件卻引發(fā)了人們對(duì)食品安全的高度關(guān)注，據(jù)聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，食源性疾病的漏報(bào)率在95％以上，其中因食源性致病微生物而引起的感染和食物中毒超過85％。食源性致病菌快速檢測一直是研究關(guān)注的焦點(diǎn)，食源性致病菌快速檢測是采用微生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理、免疫學(xué)的方法對(duì)食品及其加工、貯藏等環(huán)境中的致病菌進(jìn)行分離、檢測、鑒定和計(jì)數(shù)。

現(xiàn)在廣泛使用的食源性病原微生物檢測方法主要有以下幾種：平皿培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，PCR)與熒光PCR檢驗(yàn)方法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等。

在食源性致病微生物中，金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33％，加拿大則更多，占到45％，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，例如近期某名牌速凍水餃引起中毒的事件。因此，建立健全的食品安全標(biāo)準(zhǔn)和研究食源性致病菌的快速檢測方法就顯得尤為重要。膠體金免疫層析法自1971年被Faulk等人創(chuàng)立以來，由于其具有方便快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、不需要特殊儀器和試劑、肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。膠體金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，即氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金與抗體蛋白吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。免疫層析法是一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

傳統(tǒng)的平皿培養(yǎng)分離鑒定法是應(yīng)用微生物增菌培養(yǎng)、分離、生化鑒定等方法對(duì)食品中可能存在的食源性致病菌進(jìn)行定性和定量的檢驗(yàn)。其特點(diǎn)是穩(wěn)定可靠，是目前最成熟，使用最廣泛的細(xì)菌檢驗(yàn)方法，但是此法存在檢測時(shí)間長，過程繁瑣，對(duì)操作人員技術(shù)要求高以及對(duì)特定血清型難以分離鑒定的問題。

PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的DNA復(fù)制。樣品經(jīng)前處理增菌后，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，在加入引物后，以提取的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物是否有特征條帶，從而對(duì)樣品中是否存在食源性致病菌進(jìn)行快速檢驗(yàn)用PCR技術(shù)檢測有害微生物，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。熒光PCR即在普通PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的寡核苷酸熒光探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品的初始模版，可以通過測定放射性強(qiáng)度考查樣品中微生物數(shù)量。但是PCR反應(yīng)受樣品情況的影響比較大，特別在食源性有害微生物檢查中，食品中的成分(糖類、酸類，油脂等物質(zhì))會(huì)干擾反應(yīng)的正常進(jìn)行。而檢測的環(huán)境，中間處理環(huán)節(jié)也會(huì)帶來一些PCR反應(yīng)抑制劑，從而使PCR反應(yīng)呈現(xiàn)較高的假陽性和假陰性率。最為關(guān)鍵的是，PCR檢測無從判斷食源性病原微生物的感染性，即DNA或RNA檢測的陽性結(jié)果無法判斷是無感染性的死亡微生物還是具備感染性的活微生物。

酶聯(lián)免疫吸附分析法是把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)。該技術(shù)主要依據(jù)抗原(抗體)能結(jié)合到固相載體的表面仍具有其免役活性；抗體(抗原)與酶結(jié)合所形成的結(jié)合物仍保持免疫活性和酶的活性；結(jié)合物與相應(yīng)的抗原(抗體)反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催化底物生成有色物質(zhì)，而顏色的深淺可定量抗體(抗原)的含量。酶聯(lián)免疫吸附分析法具有靈敏度高、快速、特異性很強(qiáng)、和測試成本低等特點(diǎn)，但是此法需要大型儀器來輔助，不利于現(xiàn)場的快速檢測。同樣，酶聯(lián)免疫吸附分析法也有抗原陽性的結(jié)果無法判斷是死亡微生物還是活微生物的缺陷。