[發明專利]一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法

有效

• 申請號: 201210114497.0
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102621249A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 王益超
• 申請（專利權）人: 王益超
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強

技術領域

本發明屬于生物基樣品的多步衍生法同步分析方法領域，具體涉及采用試管或濾紙片作為標本載體的多步衍生法同步分析生物基樣品中堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法。

背景技術

尿液含有堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類等許多內源性化合物的終末或中間代謝產物，這些小分子有機化合物大多數有相對較高的水溶性和腎廓清率，其濃度通常亦高于血清和其他組織體液，如血液、CSF(腦脊液)及組織液等，其中尿標本最易于收集，為非侵入性操作性技術，為國內外研究者所認同。二十世紀我國對遺傳代謝性、營養性、線粒體性及藥物性等代謝性疾病僅能進行初步檢測，依賴歐日美等發達國家的檢測技術且需將標本送至國外合作單位方可確診；近十年來我國引進氣相色譜-質譜聯用(gas?chromatography?mass?spectrometry，GC-MS)尿有機酸檢測方法僅僅是檢測有機酸類遺傳代謝性疾病，而缺乏堿基、核苷、氨基酸及糖類等遺傳代謝性疾病的篩查、監測和研究的樣本預處理及同步分析方法，因而也嚴重影響我國各類代謝性疾病醫學領域的整體研究水平。

首先，無論是色譜柱離子交換法還是有機酸萃取法，都只能分析尿中有機酸類物質，并且數量少，鮮有超過200種物質的文獻報道；采用的是通過化學方法富集尿中有機酸，從而達到檢測尿中有機酸的目的；現有的傳統分析方法，無論是分析樣本中酸性、堿性及中性有機酸類物質的數量，還是分析樣本中物質的種類，和樣本中客觀存在的實際小分子的數量和種類相比，都存在嚴重不足，更缺乏堿基、核苷、氨基酸及糖類等物質的提取和同步分析的方法。

其次，脲素酶預處理法不經有機酸萃取直接進行GC-MS分析，用以鑒定有機酸和部分氨基酸及部分糖類代謝產物，雖然分析方法有很大的進展，但也易“漏檢”酮類酸、醛類酸等有機酸，也對堿基、核苷、氨基酸及糖類等物質的全面同步分析的方法，仍顯不足，不利于標本代謝物成分“高通量組學”全面分析；樣本是在高溫高壓下進行的三甲基硅烷化衍生，部分物質易分解，從而再“漏檢”芳香族氨基酸類、胺類、二肽類等物質。

再其次，處于代謝組學研究世界前沿水平的Fiehn數據庫中的物質，主要是針對人體、細菌及植物的生理狀態下和其遭受劇烈內外環境干擾下小分子代謝物成分“高通量組學”全面分析；分析方法取得更大的進展，但也“缺乏”堿基、核苷、有機酸、氨基酸及糖類等物質的“遺傳性代謝病”全面同步分析的方法和數據，如苯丙酮尿癥患兒尿液中獨特的病理產物苯乙酸、苯乳酸、苯丙酮酸、鄰羥基苯乙酸及扁桃酸；甲基丙二酸尿癥患兒尿液中甲基檸檬酸等應用Fiehn數據庫及其方法分析時就會“漏檢”；因而臨床應用仍顯不足，不利于標本對500余種小兒遺傳性代謝病“獨特”代謝物成分“高通量組學”全面分析；

最后，面對分析生理、病理及遺傳缺陷條件下的復雜樣本客觀需求，面對分析小分子物質數量巨大的難題和面對分析小分子物質種類眾多且理化性質各異的難點等。開發樣本預處理技術、建立代謝物標準數據庫和樣本分離及檢測技術至關重要，也是制約該領域學科發展的瓶頸。而目前，氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)等儀器很好地解決了樣本分離及檢測技術難題，成為該應用技術領域的主流分析工具之一。也就是說，剩下的攻關技術主要是開發樣本預處理技術及建立其代謝物標準數據庫，提供一種同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，是目前研究的熱點。

發明內容

針對現有色譜柱離子交換法、有機酸萃取法、脲素酶預處理法及Fiehn組學分析法等分析方法的缺陷，本發明的目的在于提供一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法。該方法以生物基樣本(尿液、血液、CSF(腦脊液)及組織液等)為檢測對象，可以一次性多步衍生法同步分析上述多種物質的代謝中間和終末產物(包括酮類、醛類等物質)，可以利用多步衍生法同步分析人體、細菌及植物等生理、病理及遺傳缺陷條件下的復雜樣本中1000多種物質。

本發明的技術方案是：

一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法(多步衍生法)，具體步驟包括：

1)取樣：收集生物基樣本；

2)定量待測樣品：對生物基樣本進行物理洗脫并收集洗脫液；測定洗脫液中肌酐含量，確定肌酐濃度，取相當于2.50μmoL/μL肌酐濃度的洗脫液25μL-300μL作為待測樣品，備用；