[發明專利]一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法

有效

• 申請號: 201210114497.0
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102621249A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 王益超
• 申請（專利權）人: 王益超
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強

1.一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，具體步驟包括：

1)取樣：收集生物基樣本；

2)定量待測樣品：對生物基樣本進行物理洗脫并收集洗脫液；測定洗脫液中肌酐含量，確定肌酐濃度，取相當于2.50μmoL/μL肌酐濃度的洗脫液25μL-300μL作為待測樣品，備用；

3)肟化處理過程，即直接在上述待測樣品中加入2.5μl-90μl肟化試劑，調PH值至7-14，密封樣品并加熱至45℃-70℃條件下，充分反應15min-90min，使待測樣品完成肟化反應，得肟化反應后的樣品；所述肟化試劑的濃度為0.01μg/μl-50μg/μl，肟化試劑選自鹽酸羥胺水溶液、甲氧基胺鹽-吡啶溶液或乙氧基胺鹽-吡啶溶液；

4)預處理：對肟化后的待測樣品進行除磷及除硫、除脲素、除蛋白、超聲和離心處理后取離心液b，離心液b再經N-三甲基硅烷基咪唑或烷基氯甲酸脂在水中衍生反應，得樣本溶液c，然后將樣本溶液c干燥，得殘留物，即為預處理后的樣品；所述干燥是指氮氣吹干或真空濃縮干燥或先氮氣吹干再真空濃縮干燥；所述除磷及除硫是指在待測樣品中加入0.08mol/L-1.2mol/L的鋇劑水溶液10μL-200μL，震蕩5-30分鐘后離心，收集離心液a；所述除脲素是指在上述離心液a中加入含脲素酶3^u/μL-6^u/μL的水溶液30μL-260μL，于25℃-42℃溫度下水浴10-45分鐘；所述除蛋白是指再加入相對于離心液a?1.5-6.7倍體積的溶劑300μL-2000μL震蕩5-30分鐘，其中所述溶劑為甲醇、乙醇、丙酮酸、乙晴或吡啶；

5)二次三甲基硅烷化衍生反應：在預處理后的樣品中加入25μL-300μL的三甲基硅烷化衍生劑，置干燥加熱器上先在3℃-60℃溫度下衍生10min-120min，再在60℃-200℃溫度下衍生10min-90min，得硅烷化衍生反應后的檢測樣品；

6)采用氣質聯用分析方法對檢測樣品中的堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物進行同步檢測。

2.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(1)中所述的生物基樣本包括尿液、血液、腦脊液或組織液。

3.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(2)中所述物理洗脫收集洗脫液是指用0.5mL-2.0mL去離子雙蒸水、1‰鹽酸-甲醇溶液分次洗脫，超聲、離心、收集洗脫液。

4.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(4)預處理過程中所述氮氣吹干是利用氮吹儀在流量為0.001-1.5mL/秒的99.99％氮氣下進行；所述真空濃縮干燥是在零下70℃至50℃的溫度，并在10Pa以內真空度的條件下進行。

5.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(4)所述鋇劑水溶液包括Ba(Cl)₂或Ba(OH)₂或Ba(NO₃)₂水溶液。

6.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(5)所述三甲基硅烷化衍生劑選自N，O-雙(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷、N，O-雙(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷按照體積比99∶1組成的混合試劑或者N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷按照體積比99∶1組成的混合試劑。

7.根據權利要求1所述一種多步衍生法同步分析堿基、核苷、有機酸、脂肪酸、氨基酸及糖類代謝產物的方法，其特征是，步驟(6)所述采用氣質聯用分析方法對檢測樣品進行檢測的條件為：以正十七烷酸或二十四烷酸或托品酸作為內標物質，采用分流式進樣，其中氦氣與檢測樣品的體積比為10-50∶1；進樣口溫度設定為190℃-250℃，以氦氣為載氣，流速為0.5-3.0mL/min，界面溫度為260℃-300℃；質譜檢測采用電子離解模式總離子掃描方式，質荷比范圍m/z：30-750，掃描周期0.1S-0.5S，色譜柱采用程序升溫，從40℃-70℃開始，以3℃/min-7℃/min的升溫速率升溫至200℃后停留2min-10min，然后以4℃/mi-12℃/min的升溫速率升溫至280℃后停留2min-10min，再以4℃/min-12℃/min的升溫速率升溫至320℃，樣本分析時間為8min-60min。