[發(fā)明專利]耐有機溶劑蛋白酶的突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210113983.0
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102660521A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設計）人: 何冰芳;莊宇;朱富成;吳斌
• 申請（專利權）人: 南京工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/15;C12P21/06;C12R1/385
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 樊文紅

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程研究領域，涉及耐有機溶劑蛋白酶的突變體，具體的是通過基因工程改造得到的在有機溶劑中具有高穩(wěn)定性的蛋白酶。

背景技術

生物催化技術廣泛用于制藥、精細化工等合成領域，然而通常反應所用的底物或中間體水溶性差，因此在非水介質中的酶催化反應是推動該領域發(fā)展的關鍵技術。而多數酶在有機溶劑中不穩(wěn)定、易失活，如何提高酶分子在有機溶劑中的穩(wěn)定性成為了關鍵瓶頸。現有技術對在有機溶劑中進行酶催化的研究著重于酶催化介質工程、酶的物理化學修飾及固定化等技術，往往難以高效地改善酶的有機溶劑穩(wěn)定性及催化反應效率，挖掘和開發(fā)在有機溶劑中具有高活性及高穩(wěn)定性的酶類是十分迫切的，可提升生物催化工程的關鍵理論與技術。

Arnold等(J.?Am.?Chem.?Soc.?113,?6336-6337)對α-裂解蛋白酶表面四個帶電氨基酸殘基進行定點飽和突變，獲得的多個突變體在84%DMF中穩(wěn)定性提高。Rhee等(Biochim.?Biophys.?Acta.-Protein?Struct.?Mol.?Enzymol.?1547,?370-378)通過定向進化技術獲得了磷脂酶A1的三個突變體（SA8、SA17及SA20）在50%DMSO中的半衰期約是野生型的4倍。Reetz?(Chem.?Commun.?46,?8657-8658)基于迭代飽和突變技術獲得的枯草桿菌脂肪酶突變體在乙腈、DMSO及DMF等有機溶劑中的穩(wěn)定性顯著提高。Dalfard等(J.?Biochem.?148,?231-238)通過定點突變提高了Salinivibrio?proteolyticus來源的蛋白酶在多種有機溶劑中的穩(wěn)定性，降低了其在有機相中的熱失活速率。以上現有技術的文獻顯示出蛋白質分子改造手段對于提高酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性具有突出的優(yōu)勢，然而在實驗水平上還沒有成熟的相關理論報道，更沒有可借鑒的分子改造方法。而運用定向進化策略對酶穩(wěn)定性進行改造研究具有較高的可行性。

近年來蛋白酶在有機相中的反應多樣性越來越受到人們的關注，其可進行合成小肽合成、糖軛合物，轉酯反應以及動力學拆分等，在醫(yī)藥中間體、日用品、化妝品、生物材料等領域具有廣泛的應用前景。然而大多數蛋白酶在有機相中也容易失活，因此，提高蛋白酶在有機相中的穩(wěn)定性對于推動蛋白酶非水相生物催化應用的發(fā)展具有突出的意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的技術目的在于對本發(fā)明人團隊在先授權專利的蛋白酶進行定向進化，以得到在有機溶劑中具有更高穩(wěn)定性的蛋白酶；本發(fā)明的另一個技術目的在于提供該酶在有機相中催化小肽合成的應用，為有機相肽合成的工業(yè)化進程進一步提供基因資源。

一、本發(fā)明通過定向進化技術對銅綠假單胞菌來源的耐有機溶劑蛋白酶PT121基因（見授權中國申請，授權公告號CN?101240254?B）進行分子改造，使改造后的蛋白酶的突變體在有機溶劑穩(wěn)定性方面更加優(yōu)良。該耐有機溶劑蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。其中，所述的SEQ?ID?No:1是在先授權專利CN?101240254?B中所述的銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）PT121所產的蛋白酶的成熟肽部分，編碼301個氨基酸。

進一步地，所述的蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列表現出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。

更進一步地，所述的蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列表現出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。

更進一步地，所述的另一種氨基酸殘基優(yōu)選自下述的氨基酸：第46位：酪氨酸（氨基酸縮寫名稱為Y）；第224位：苯丙氨酸（氨基酸縮寫名稱為F）或酪氨酸（氨基酸縮寫名稱為Y）。