[發(fā)明專利]耐有機(jī)溶劑蛋白酶的突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210113983.0
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102660521A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何冰芳;莊宇;朱富成;吳斌
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12N15/57;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/15;C12P21/06;C12R1/385
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 樊文紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程研究領(lǐng)域，涉及耐有機(jī)溶劑蛋白酶的突變體，具體的是通過基因工程改造得到的在有機(jī)溶劑中具有高穩(wěn)定性的蛋白酶。

背景技術(shù)

生物催化技術(shù)廣泛用于制藥、精細(xì)化工等合成領(lǐng)域，然而通常反應(yīng)所用的底物或中間體水溶性差，因此在非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)是推動(dòng)該領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。而多數(shù)酶在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定、易失活，如何提高酶分子在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性成為了關(guān)鍵瓶頸。現(xiàn)有技術(shù)對在有機(jī)溶劑中進(jìn)行酶催化的研究著重于酶催化介質(zhì)工程、酶的物理化學(xué)修飾及固定化等技術(shù)，往往難以高效地改善酶的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性及催化反應(yīng)效率，挖掘和開發(fā)在有機(jī)溶劑中具有高活性及高穩(wěn)定性的酶類是十分迫切的，可提升生物催化工程的關(guān)鍵理論與技術(shù)。

Arnold等(J.?Am.?Chem.?Soc.?113,?6336-6337)對α-裂解蛋白酶表面四個(gè)帶電氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得的多個(gè)突變體在84%DMF中穩(wěn)定性提高。Rhee等(Biochim.?Biophys.?Acta.-Protein?Struct.?Mol.?Enzymol.?1547,?370-378)通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得了磷脂酶A1的三個(gè)突變體（SA8、SA17及SA20）在50%DMSO中的半衰期約是野生型的4倍。Reetz?(Chem.?Commun.?46,?8657-8658)基于迭代飽和突變技術(shù)獲得的枯草桿菌脂肪酶突變體在乙腈、DMSO及DMF等有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性顯著提高。Dalfard等(J.?Biochem.?148,?231-238)通過定點(diǎn)突變提高了Salinivibrio?proteolyticus來源的蛋白酶在多種有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，降低了其在有機(jī)相中的熱失活速率。以上現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)顯示出蛋白質(zhì)分子改造手段對于提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性具有突出的優(yōu)勢，然而在實(shí)驗(yàn)水平上還沒有成熟的相關(guān)理論報(bào)道，更沒有可借鑒的分子改造方法。而運(yùn)用定向進(jìn)化策略對酶穩(wěn)定性進(jìn)行改造研究具有較高的可行性。

近年來蛋白酶在有機(jī)相中的反應(yīng)多樣性越來越受到人們的關(guān)注，其可進(jìn)行合成小肽合成、糖軛合物，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以及動(dòng)力學(xué)拆分等，在醫(yī)藥中間體、日用品、化妝品、生物材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而大多數(shù)蛋白酶在有機(jī)相中也容易失活，因此，提高蛋白酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定性對于推動(dòng)蛋白酶非水相生物催化應(yīng)用的發(fā)展具有突出的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)目的在于對本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在先授權(quán)專利的蛋白酶進(jìn)行定向進(jìn)化，以得到在有機(jī)溶劑中具有更高穩(wěn)定性的蛋白酶；本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)目的在于提供該酶在有機(jī)相中催化小肽合成的應(yīng)用，為有機(jī)相肽合成的工業(yè)化進(jìn)程進(jìn)一步提供基因資源。

一、本發(fā)明通過定向進(jìn)化技術(shù)對銅綠假單胞菌來源的耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121基因（見授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號CN?101240254?B）進(jìn)行分子改造，使改造后的蛋白酶的突變體在有機(jī)溶劑穩(wěn)定性方面更加優(yōu)良。該耐有機(jī)溶劑蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。其中，所述的SEQ?ID?No:1是在先授權(quán)專利CN?101240254?B中所述的銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）PT121所產(chǎn)的蛋白酶的成熟肽部分，編碼301個(gè)氨基酸。

進(jìn)一步地，所述的蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。

更進(jìn)一步地，所述的蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ?ID?No:1表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ?ID?No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。

更進(jìn)一步地，所述的另一種氨基酸殘基優(yōu)選自下述的氨基酸：第46位：酪氨酸（氨基酸縮寫名稱為Y）；第224位：苯丙氨酸（氨基酸縮寫名稱為F）或酪氨酸（氨基酸縮寫名稱為Y）。