[發明專利]幽門螺旋桿菌毒力蛋白質組的制備方法

無效

• 申請號: 201210113718.2
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN102643850A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 金守光;楊洪江
• 申請（專利權）人: 天津天佛羅生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/80;C07K14/20;C07K1/22;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于蛋白質組學領域，尤其是一種幽門螺旋桿菌毒力蛋白質組的制備方法。

背景技術

幽門螺旋桿菌(Helicobacter?pylori，Hp)在1983年由澳大利亞醫生發現，呈螺旋狀，為革蘭氏陰性菌，定殖于人胃部。幽門螺旋桿菌感染是引起人類消化道疾病的重要原因，能夠導致慢性胃炎、嚴重萎縮性胃炎、消化道潰瘍和胃癌等相關疾病。

幽門螺旋桿菌存在多種毒力因子，包括鞭毛蛋白(flagellin)、空泡毒素(vacuolating?cytotoxin，VacA)、細胞毒素相關蛋白(cytotoxin?associated?gene?A，CagA)和尿素酶(urease)等。鞭毛蛋白是幽門螺旋桿菌鞭毛的主要組成蛋白，是細菌運動的動力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性環境，對鞭毛具有保護作用，運動能力較強的菌株其致病性較高。空泡毒素VacA能夠分泌到細菌外部，對胃上皮細胞造成損傷，產生空泡性病變，另外能夠改變細胞膜的離子通透性，導致細胞整體病變。所有幽門螺旋桿菌存在VacA編碼基因，但是只有約50％的菌株表達VacA蛋白。細胞毒素相關蛋白(CagA)分子量為128kD，存在于60-70％的幽門螺旋桿菌菌株中，具有CagA為I型菌株，具有較強致病性，CagA陰性為II型菌株，致病性較弱，在胃炎患者中中，CagA抗體陽性率為70-75％，在十二指腸潰瘍患者中，CagA抗體陽性率幾乎為100％。尿素酶產生高濃度氨，導致細胞空泡病變。

西方國家30-50％的人群感染過幽門螺旋桿菌，我國幽門螺旋桿菌感染率高達70-90％，隨著年齡增長，感染率有增加的趨勢。感染人群中的10％的患者會出現臨床癥狀，包括胃炎、胃十二指腸潰瘍等，若不接受抗菌素治療，感染可持續終生，其中部分患者可能導致胃癌。

目前檢測幽門螺旋桿菌感染的方法較多，包括檢測患者血清中的幽門螺旋桿菌抗體、糞便中幽門螺旋桿菌的抗原、尿素呼氣試驗、定量PCR方法、細菌培養方法和病理學檢測方法等。其中，檢測患者血清中的幽門螺旋桿菌抗體，包括酶聯免疫吸附試驗、免疫印記和膠體金等方法，具有特異性高，能夠定量分析的特點，但是試驗中涉及的幽門螺桿菌抗原，為部分純化的幽門螺旋桿菌全抗原，其特異性和穩定性等方面不能完全滿足檢測要求。

發明內容

本發明在于在于克服現有技術的不足之處，提供一種幽門螺旋桿菌毒力蛋白質組的制備方法，本蛋白組可以用于基因工程疫苗和臨床診斷試劑盒的候選抗原。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種幽門螺旋桿菌毒力蛋白質組的制備方法，步驟如下：

(1)分別擴增6種毒力蛋白基因，針對6種毒力蛋白設計引物，引物序列見序列1至序列12，引物分別插入限制性內切酶位點；

(2)分別克隆6種毒力蛋白編碼基因；

(3)分別亞克隆6種毒力蛋白編碼基因到表達載體上；

(4)大腸桿菌宿主細胞內分別表達6種毒力蛋白；

(5)純化；

所述6種毒力蛋白為細胞毒素相關蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亞基A、鞭毛蛋白亞基B、尿素酶亞基A和尿素酶亞基B。

而且，所述步驟(2)的6種毒力蛋白編碼基因分別克隆到TOPO?TAKits試劑盒或T-EASAY試劑盒的質粒載體上。

而且，所述步驟(3)的6種毒力蛋白編碼基因分別亞克隆到表達載體pQE30上。

而且，所述步驟(5)利用Ni-NTA純化填料制備的層析柱，分離純化這6種重組毒力蛋白。

本發明的有益效果和優點是：

本發明涉及的6種毒力蛋白包括細胞毒素相關蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亞基A、鞭毛蛋白亞基B、尿素酶亞基A和尿素酶亞基B，其編碼基因或氨基酸序列具有高度保守性和特異性，并且與患者的癥狀相關，因此制備的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和臨床診斷試劑盒的候選抗原，以及臨床用藥指導以及流行病學調查等多個領域。

附圖說明

圖1為本發明幽門螺旋桿菌毒力蛋白編碼基因的PCR擴增產物分析，其中，1cagA，2vacA，3ureA，4ureB，5flaA，6flaB；