[發明專利]一種用發光細菌對抗生素類物質毒性進行檢測的方法

無效

• 申請號: 201210113701.7
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102634564A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 李娟英;王靜;彭自然
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所 31230
• 代理人: 陳偉勇

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及發光細菌檢測技術領域，特別涉及一種用發光細菌對抗生素類物質毒性進行檢測的方法。

背景技術

發光細菌是一種廣泛存在的能發出藍綠色可見光的細菌，其主要分布在海洋中，或者自由生活，或者寄生于海洋或陸生動物體。

發光細菌的發光過程是一種光呼吸過程，是電子傳遞鏈上的一個側支，還原型的黃素單核苷酸(FMNH₂)充當反應的底物，螢光酶起催化作用，長鏈脂肪醛起作改變螢光酶構造的“修飾”作用。螢光酶通過分子氧催化(FMNH₂)和脂肪醛(RCHO)的氧化，這種氧化還原反應結果便產生磷光，波長465～490nm之間較多。

外界環境條件如pH、溫度、氧濃度的變化都會影響發光細菌的發光強度；而有毒的化學物質，如重金屬離子、抗生素、化學治療劑、農藥等同樣會影響發光細菌的發光狀況，因此，采用發光細菌作為敏感指標物測定抗生素類污染物的生物毒性在科研實踐中是可能的。

經過幾代科學家的努力，已成功提取和培養出發光細菌制劑并研制出與之配套的現代光電檢測設備，從而形成了成熟的發光細菌毒性檢測體系和方法。與傳統的生物毒性實驗相比，發光細菌毒性實驗反應時間短、靈敏度高，并且由于是用發光量定量表征污染環境的生物監測方法，因而能夠對環境的變化做出快速反應，有助于對環境質量進行綜合評價。

標準的發光細菌急性毒性實驗因其作用時間短，僅僅適用于那些快速表現出毒性的化合物的測定，對于測定那些影響生物生長繁殖過程的化合物的毒性，實驗歷經時間必須超過細菌的世代時間。抗生素類物質因其特殊的作用機制(主要是干擾轉錄、蛋白質的合成以及繁殖過程)，單純依據標準發光細菌急性毒性實驗方法獲得的結果可能會嚴重低估抗生素類污染物的生物毒性。標準毒性實驗結果主要反映細胞內部能量狀態的變化，影響細胞物質合成的化合物的毒性在這么短的時間里變化很小，因此檢測結果并未反應真實的狀況。

此外，標準的發光細菌急性毒性實驗僅適用于可溶性的有毒有害物質的檢測，對不溶或微溶化學物質的檢測未作詳細的規范指導，使得其應用范圍受限。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種應用更加廣泛和準確的發光細菌檢測抗生素類毒性的改進方法，解決了現有技術中無法檢測抗生素類污染物的延遲毒性、對不溶或微溶化學物質檢測不精確等問題。

為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是：一種用發光細菌對抗生素類物質毒性進行檢測的方法，包括如下步驟；

1)配制抗生素母液并將母液稀釋至實驗所需濃度；

2)制備發光細菌凍干粉復蘇液；

3)空白對照制備：對于溶解性的抗生素，將發光細菌復蘇液作為空白對照；對于不溶或微溶性的抗生素，將含有與對應待測樣品具有相同含量二甲基亞砜的復蘇液作為空白對照；

4)待測樣品溶液制備：取不同濃度的待測樣品加入到干凈的測試管中，搖勻；

5)將空白對照和待測樣品相間放置于測試架上；

6)按順序向各個測試管中加入復蘇的發光細菌凍干粉(根據發光量和儀器要求調節加入量)，兩管加入時間相隔15-30s，輕輕振蕩，使之均勻，

7)EC50值的計算：以待測樣品濃度的對數為橫坐標，對應的相對發光率為縱坐標作圖，求得其EC50值，即相對發光率在50％的樣品的濃度；

其特征在于，所述步驟6)的放置后，向各個管中按比例依次加入發光細菌的完全培養基，使抗生素類物質與發光細菌作用時間延長至12-36h后在水質毒性檢測儀測定發光量。

優選地，所述抗生素類物質與發光細菌作用時間延長至24個小時。

優選地，抗生素類物質與發光細菌在20-25℃條件下培養。

優選地，所述抗生素類物質，包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氯霉素類、林可酰胺類。

優選地，所述抗生素類物質，包括四環素類和磺胺類抗生素。

優選地，所述四環素類抗生素，具體包括四環素(CTC)、土霉素(OTC)或金霉素(TC)、強力霉素。

優選地，所述的抗生素類物質為不溶或微溶物質時，在配置的抗生素類母液中加入二甲基亞砜，加入量不超過總體積的千分之一。

實驗證明少量的二甲基亞砜對發光細菌的發光量不產生影響，而且采用二甲基亞砜溶解不溶或微溶抗生素類物質后，再將不溶或微溶抗生素毒性物質制成溶液后進行實驗，擴大了發光細菌的應用范圍。