[發明專利]鑒定雞新城疫病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法

無效

• 申請號: 201210113485.6
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN103374631A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 張國中;唐娜;秦秀慧
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及RT-PCR檢測技術，具體地說，涉及鑒定雞新城疫病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法。

背景技術

新城疫(Newcastle?disease，NDV)是目前嚴重危害養禽養殖業的主要傳染病之一，其病原為新城疫病毒(Newcastle?disease?virus，NDV)。根據國際病毒分類委員會(International?Committeeon?Taxonomy?of?Viruses，ICTV)關于病毒的最新分類報告，NDV歸屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)。雖然目前NDV只有一個血清型，卻具有明顯的基因多樣性，根據F基因序列分析至少可以劃分為10個基因型。系統的分子流行病學調查結果顯示基因VII型是當前世界范圍內最主要的流行毒株，近期亞洲、歐洲、非洲、中東以及南美洲的ND爆發大多與該基因型毒株有關。目前常用的NDV疫苗株是LaSota株，屬于基因II型毒株，與基因VII型流行毒株存在較大的差別。

傳統的新城疫病毒實驗室檢測方法為病毒分離鑒定，需要將臨床可疑病料處理后接種合適的載體(如雞胚、雞胚成纖維細胞等)進行病毒分離，通過血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗對分離到的可疑病毒進行鑒定，一般還要通過最小致死量致死雞胚的平均時間(MDT)測定，1日齡雛雞腦內接種致病指數(ICPI)的測定和6周齡雛雞靜脈接種致病指數(IVPI)測定確定分離病毒的毒力強弱，因此相對比較費時費力。

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外擴增特異性基因片段的技術，在疾病的檢測方面有著廣闊的應用前景，近年已越來越多的被廣泛應用。利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)能夠選擇性地將雞新城疫病毒基因組的一個特異性短片段放大10萬倍以上，極大地增強了檢測的敏感性。但我國對新城疫的控制主要是利用疫苗進行免疫防控，利用常規RT-PCR不能夠區分NDV疫苗株和野毒株，給臨床診斷帶來一定的困難。

系統研究顯示，目前我國流行的NDV主要流行株(基因VII型)與常用疫苗株(基因II型)存在明顯基因差異。國內基因VII型野毒株F和HN基因核苷酸同源率均在93％以上，但與LaSota疫苗株的同源率均僅80％左右。這種基因差異為建立RT-PCR方法鑒別常用疫苗株與主要流行野毒株提供了可能。

發明內容

本發明的目的在于克服現有檢測手段的不足，提供一種采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術對雞新城疫病毒疫苗株和流行株感染進行快速鑒別檢測的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種鑒定雞新城疫病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法，包括以下步驟：

1)臨床樣品經預處理后，提取樣本總RNA。

2)反轉錄(RT)得到樣本cDNA。

3)以樣本cDNA為模板，使用以下引物組合進行PCR擴增。

上游引物P1：5’-GTCGTGCTCAGTGATGTG-3’；

上游引物P2：5’-GCTCCGCCTACTCCGTCAG-3’；

下游引物P3：5’-TTGTTACCTCAATGTGCC-3’；以及

下游引物P4：5’-GCAGGAACTTGACTATGA-3’。

4)分析PCR擴增產物，結果判定。即對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據電泳結果確定樣品中能否擴增出各目的條帶。如果無目的條帶則為雞新城疫病毒檢測陰性；如果擴增出通用目的條帶(646bp)和基因II型目的條帶(339bp)則為基因II型雞新城疫病毒檢測陽性；如果擴增通用目的條帶(646bp)和基因VII型目的條帶(452bp)則為基因VII型雞新城疫病毒檢測陽性；如果同時擴增出通用目的條帶、基因II型和基因VII型目的條帶則為基因II型和基因VII型雞新城疫病毒檢測陽性；如果僅擴增出通用條帶則為非基因II型和基因VII型的新城疫病毒檢測陽性。