[發(fā)明專利]膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定人甲胎蛋白含量的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210113245.6
• 申請(qǐng)日: 2012-04-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102662061A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐麗;高愛(ài)民;劉希
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;朱慧寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法測(cè)定人體體液(包括血清和羊水)中甲胎蛋白含量的試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甲胎蛋白(α-fetoprotein，或AFP)，分子量為68kD，是一條多肽鏈糖蛋白，由590個(gè)氨基酸組成，含糖量4％。甲胎蛋白的基因位于常染色體的4q11～q22區(qū)域，基因約有20kb長(zhǎng)，含15個(gè)外顯子，14個(gè)內(nèi)含子，與血清白蛋白、維生素D結(jié)合蛋白為同一家族，與白蛋白有50％的氨基酸相同，等電點(diǎn)4.7～4.8，電泳時(shí)位于白蛋白與α-球蛋白之間。

在胎兒發(fā)育過(guò)程中，肝臟是合成甲胎蛋白的主要場(chǎng)所，其次是卵黃囊，來(lái)自內(nèi)胚層的胃腸道粘膜也可以合成少量的甲胎蛋白。人體胚胎的第6周開(kāi)始合成，12～14周合成達(dá)到高峰，血清的濃度為1～3mg/mL，以后逐漸降低，出生時(shí)血清濃度約為19～100μg/mL，一年后，血清濃度降至正常水平，約為5.8ng/mL。

正常人血清中甲胎蛋白含量極少，低于20ng/ml。但在原發(fā)性肝癌、肝炎、肝硬化及卵黃囊腫瘤等患者中，甲胎蛋白會(huì)有不同程度的升高，有的甚至升高上千倍以上；孕期母體的血清或羊水中甲胎蛋白也高于正常人，因受胎兒血中高濃度甲胎蛋白波動(dòng)影響，不同孕期甲胎蛋白濃度有規(guī)律的變化。

甲胎蛋白作為一種腫瘤標(biāo)志物，其含量變化與多種疾病有關(guān)，包括肝細(xì)胞癌、卵黃囊腫瘤、非內(nèi)胚層胃腸道癌、生殖細(xì)胞癌等。甲胎蛋白在臨床診斷上主要用于以下三方面：

1.肝細(xì)胞癌：早期診斷，高危人群的篩查、分期及預(yù)后的診斷、療效檢測(cè)；

2.卵黃囊腫瘤：早期診斷，且與治療效果相關(guān)，其上升與下降可反映內(nèi)胚竇瘤的生長(zhǎng)狀況、病情進(jìn)展與緩解；

3.產(chǎn)科檢查：篩查神經(jīng)管缺陷、非整倍體的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志物。

甲胎蛋白的檢測(cè)方法較多，傳統(tǒng)的包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、時(shí)間分辨熒光(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光(CLIA)免疫分析方法等。其中，化學(xué)發(fā)光方法的靈敏度和線性都較高，檢測(cè)范圍可以達(dá)到1～1000ng/mL，但試劑成本相對(duì)較高且配套的大型儀器比較昂貴。酶聯(lián)免疫法應(yīng)用較普遍，但該方法為非均相免疫檢測(cè)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)使用過(guò)量的固定化抗體和標(biāo)記抗體，實(shí)現(xiàn)高靈敏度和較高水平的精確性；缺點(diǎn)在于：測(cè)定過(guò)程中需要進(jìn)行洗滌分離步驟，耗時(shí)長(zhǎng)，缺少單位測(cè)試運(yùn)行時(shí)間；自動(dòng)化程度不高，批間差和重復(fù)性相對(duì)較大；針對(duì)不同的步驟需要配備多種專門的設(shè)備，一定程度上增加了產(chǎn)品的成本。

近年來(lái)，由于不斷增長(zhǎng)的檢測(cè)數(shù)量，臨床上迫切需要一種更為簡(jiǎn)便、快速的方法取代傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)甲胎蛋白是基于均相免疫分析測(cè)定系統(tǒng)的一種方法，在普通的生化分析儀上即可完成反應(yīng)全程，可實(shí)現(xiàn)快速、高高通量樣本的檢測(cè)。由于甲胎蛋白在正常人體內(nèi)含量相對(duì)較低，利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁均相免疫分析測(cè)定時(shí)，一般采用較高的樣本量來(lái)彌補(bǔ)此法靈敏度低的缺陷；但靈敏度得以提高的同時(shí)又將面臨高的樣本量引入的干擾物質(zhì)，如類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體等，造成的非特異性反應(yīng)。

為克服高樣本引入的非特異性反應(yīng)，現(xiàn)在市售的膠乳比濁法檢測(cè)甲胎蛋白試劑盒通常采取用多克隆抗體IgG酶切得到的F(ab)’₂包被膠乳顆粒，在一定程度上降低了非特異性反應(yīng)。但F(ab)’₂需要由IgG經(jīng)酶切純化后方可使用，酶切制備工藝中會(huì)損失一部分抗體且對(duì)抗體活性也有一定程度影響，更重要的是試劑制備過(guò)程進(jìn)一步復(fù)雜對(duì)控制試劑批間差設(shè)置了不可逾越的障礙。試劑批間差的主要影響因素由原來(lái)單純的交聯(lián)工藝控制，擴(kuò)大到酶切純化抗體工藝控制。該法不僅推高了試劑成本，批間差較大，并且開(kāi)瓶后穩(wěn)定性較差，從而限制了此類試劑在臨床上的推廣。

IgY類抗體是一類來(lái)源禽類，如雞、鴨、鵝等體內(nèi)產(chǎn)生的主要抗體形式。研究證實(shí)，來(lái)源于禽類的抗體(IgY)與哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體(主要為IgG)相差較大。IgY不能激活人體補(bǔ)體系統(tǒng)，不與類風(fēng)濕因子或Fc受體相結(jié)合，能有效避免在免疫檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生假性結(jié)果，保證了試劑的較高特異性。同時(shí)，在遺傳上與人類進(jìn)化關(guān)系差別較大的禽類產(chǎn)生的抗體具有比哺乳動(dòng)物多克隆抗體更高親和性，此類抗體效價(jià)高用量相對(duì)降低，試劑成本方面也有一定優(yōu)勢(shì)。

綜上，若將IgY抗體應(yīng)用于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，代替F(ab)’₂來(lái)檢測(cè)人體甲胎蛋白的含量，不僅保證了試劑的特異性也簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，便于控制試劑批間差，還可以有效降低成本，臨床推廣具有顯著的優(yōu)勢(shì)。