[發明專利]一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法

有效

• 申請號: 201210113210.2
• 申請日: 2012-04-18
• 公開（公告）號: CN103074326A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 徐洪偉;周曉馥;未曉巍
• 申請（專利權）人: 吉林師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 吉林省長春市新時代專利商標代理有限公司 22204
• 代理人: 石岱

技術領域

本發明涉及一種高山植物基因組DNA提取的方法，屬于基因工程技術領域，具體的說涉及一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法。

背景技術

由于高山植物環境條件惡劣，所以高山植物通常被認為是陸地上最為極端的生物，但是高山植物卻也擁有豐富極具價值的基因資源。自1896年以來，作為生物進化研究中的熱點和難點，高山和極地植物對生境的適應機制和策略一直倍受研究者們的關注。高山植物基因組DNA的提取技術是進行植物分子生物學研究的基本技術之一，DNA產率的高低，質量的好壞直接影響到后續實驗的成敗。探討高山植物基因組DNA的提取方法是一項非常有意義的工作，為確保在農作物環境脅迫抗性育種方面提供優異種質和選擇指標、為農業基礎研究與基因工程提供相關基因。將這種特殊的基因資源應用在觀賞陸地植物，將保護與合理利用有效結合，走人與自然和諧發展的可持續性發展道路，這不僅有利于該區域植被的生長發育、生態系統的穩定，更有利于地區經濟的發展。

高山植物的基因組提取方法有多種，近年來，人們一直致力于研究一種高效快速的提取方法，但是由于物種的特異性，高山植物的基因組提取起來并不是那么方便，。高山植物生存的環境溫度低，輻射強，在這樣的環境中，植物生長極其緩慢，產物消耗減少，為提高其抵御寒冷和生理干旱方面，使部分糖分和脂類物質積累并儲存于葉片組織細胞中，使得高山植物基因組DNA的提取難度加大。王卓偉，等在對桑葉DNA提取方法研究過程中發現PVP還能有效地去除多糖。羅志勇等在研究中對這種方法進行了幾點改進:①提高CTAB的濃度;②對于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中?-巰基乙醇的含量，同時加入PVP使其與多酚類物質結合形成復合物；③增加低鹽沉淀緩沖液的量;④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA;?Porebski,等在沉淀粗提?DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5?mol·L^-1以使DNA在高鹽緩沖條件下優先沉淀，可更有效地除去多糖。余志雄對火龍果總DNA提取方法比較研究驗證了CTAB法對火龍果基因組提取是有效，而且應雄美對兩種不同甘蔗基因組DNA提取方法的比較，同時證明了SDS和CTAB法都能提取到基因組DNA并且對兩種方法進行了改進。

長白山杜鵑是一種有代表性高山植物，在海拔1700?m-2500?m海拔帶均有分布，其生理生化指標較為特殊，關于本研究中提到的長白山杜鵑基因組提取的方案也有多種，但是不同方法對不同植物的基因組提取效果大不相同。對于杜鵑的基因組DNA提取方面的研究還是很少的。趙喜華，等以杜鵑屬常綠杜鵑亞屬井岡山杜鵑樹葉為材料分別采用CTAB法、堿裂解法、SDS法提取杜鵑基因組DNA，三種方法所提取的DNA純度及產率有差別，其中CTAB法較好。莊得鳳,曹后男,采用CTAB法（①取0.2?g?左右研磨好的新鮮葉片置于1.5?mL?離心管中,?加800?ul?經65℃預熱的CTAB?(?2%?CTAB;?100?mmol·L^-?1?Tris?-HCl?,?pH8.0；20?mmol·L^-?1?EDTA；1.4?mol·L^-?1?NaC1；2%?PVP?)?提取緩沖液,?研磨前加入2%?β-?巰基乙醇；充分混勻后,?在水浴鍋中65℃溫浴1h；等）提取幾個品種長白山杜鵑的基因組DNA,?所得的DNA?純度高、質量好，但是牛皮杜鵑及孢葉杜鵑基因組未能提取出來。本實驗用SDS法提取植物基因組（魏群.分子生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,2007.）的方法：“取0.2g新鮮植物葉片，在液氮中研磨成粉末狀；轉移至2?mL離心管中，加入800?ul細胞提取液（pH?8.0，100?mmol·L^-1?Tris·HCl,?5?mmol·L^-1?EDTA,?500?mmol·L^-1?NaCl,?1.25%?SDS,?100?ul?β-巰基乙醇?），充分混勻；65^oC水浴保溫20分鐘;?從水浴中取出離心管，加入250?ul?5?mol·L^-1?KCl溶液，混勻，冰浴20分鐘；等”來提取長白山杜鵑的基因組，未能成功提取出其基因組DNA。

發明內容

針對上述不足，本發明的目的在于克服現有技術對長白山杜鵑基因組DNA提取方法中，基因組提取困難、純度低、易降解的不足，提供一種新的長白山杜鵑基因組DNA提取的方法，從而獲得純度高、穩定性強的長白山杜鵑基因組DNA。