[發明專利]鑒定雞傳染性支氣管炎病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法

有效

• 申請號: 201210112760.2
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102643931A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 張國中;唐娜;龔一;秦秀慧
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及RT-PCR檢測技術，具體地說，涉及鑒定雞傳染性支氣管炎病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法。

背景技術

雞傳染性支氣管炎(Avian?Infectious?Bronchitis，IB)是雞的一種急性、高度傳染性的上呼吸道疾病，病原為傳染性支氣管炎病毒(Infectious?Bronchitis?Virus，IBV)。IBV疫苗防控中的主要難點是該病毒血清型較多，并且不同血清型之間缺少有效的交叉保護性。因此生產中有效區分IBV疫苗株和流行野毒株并明確其血清型對該病的防控至關重要。

目前針對傳染性支氣管炎病毒進行病原學檢測的方法主要有病毒分離鑒定和RT-PCR方法。病毒分離鑒定要將臨床樣品處理后接種合適的載體(通常是SPF雞胚)通過觀察特征性的雞胚病變(侏儒胚)來進行初步鑒定，初步分離物還要通過中和試驗進行進一步鑒定和進行血清分型，因此費時費力。常規RT-PCR方法由于M41類活疫苗的廣泛使用而不能夠區分疫苗毒和野毒株，具有明顯的局限性。

對雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的系統研究結果表明，目前我國IBV臨床上主要存在兩種類型的毒株，一種為M41血清型毒株，約占25％，利用M41相關疫苗(如H120、H52、Ma5等)可有效進行防控。另一種毒株類型為A2-Like毒株，約占70％左右，必須使用對應的疫苗才能進行有效防控。這兩類毒株之間的核苷酸同源性通常只有87％左右，這種明顯的基因差異的存在為設計引物，建立更加實用的PCR檢測方法提供了可能。

發明內容

本發明的目的在于克服現有檢測手段的不足，提供一種采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術對雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株和流行株感染進行快速鑒別檢測的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種鑒定雞傳染性支氣管炎病毒流行株與疫苗株的RT-PCR法，包括以下步驟：

1)臨床樣品經預處理后，提取樣本總RNA。

2)反轉錄(RT)得到樣本cDNA。

3)以樣本cDNA為模板，使用以下引物組合進行PCR擴增。

上游引物P1：5’-GACCACAGTCACGCACAA-3’；

下游引物P2：5’-AATCTCCTCGGGTTCATC-3’；

下游引物P3：5’-AACTACACTCAACAATGGA-3’；以及

下游引物P4：5’-CCTGATTCTTCTTGATAC-3’。

4)分析PCR擴增產物，結果判定。即對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據電泳結果確定樣品中能否擴增出各目的條帶。如果無目的條帶則為雞傳染性支氣管炎病毒檢測陰性；如果擴增出通用目的條帶(182bp)和疫苗株目的條帶(470bp)則為雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株檢測陽性；如果擴增出通用目的條帶(182bp)和流行株目的條帶(355bp)則為雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測陽性；如果同時擴增出通用目的條帶和疫苗株、流行株目的條帶則為疫苗株與流行株雞傳染性支氣管炎病毒檢測陽性，如果僅擴增出通用目的條帶(182bp)則證明為其他類型毒株的傳染性支氣管炎病毒檢測陽性。

本發明參照GenBank上登錄的雞傳染性支氣管炎病毒基因組的高度保守區段以及雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株和流行株(GenBank登錄號分別為FJ888351、AY851295、EU817497)基因組的基因型間高度差異的區段設計4條檢測引物序列：引物P1、引物P2、引物P3和引物P4。引物P1與P2組合可擴增182bp的雞傳染性支氣管炎病毒通用目的基因片段，引物P1與P3組合可擴增355bp的流行株特異性目的基因片段，引物P1與P4組合可擴增470bp的常用疫苗株目的基因片段，適用于對雞傳染性支氣管炎病毒常用疫苗株和主要流行野毒株進行快速鑒別檢測。

前述檢測方法中，步驟2)中反轉錄生成cDNA的方法為：

在0.2ml離心管內加入下列成分：

RNA溶液????????????????????6μl

500μg/ml隨機引物??????????1μl

輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min；

然后向上述離心管中加入下列成分：

輕輕混勻，將上述反應體系置于37℃?1h，95℃?5min，得到樣本cDNA。

前述檢測方法中，步驟3)中PCR反應體系以20μl計為：