[發明專利]快速純化細菌莢膜多糖的方法

有效

• 申請號: 201210112371.X
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102660601A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 李建平
• 申請（專利權）人: 江蘇康泰生物醫學技術有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C08B37/00;C12R1/46;C12R1/21;C12R1/01
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 周祥生

技術領域：

本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種能夠從細菌發酵液中去除污染物，純化莢膜多糖的方法。

背景技術：

肺炎球菌，b型流感嗜血桿菌，流行性腦膜炎球菌以及傷寒桿菌是威脅人類生命的重要致病菌。開發疫苗來預防這些病菌的感染是醫學界多年奮斗的目標。自上世紀60年代，通過實驗發現這些細菌有一個共同的形態學結構特點，就是細胞膜表面包裹著一層莢膜，這層莢膜是由多糖包裹在細菌細胞膜表面形成，故稱莢膜多糖。在人體內，莢膜對于這些細菌致病性起著決定性作用，因為，通過防止抗體吸附到細菌膜上，莢膜能夠干擾免疫細胞對細菌的吞噬作用，使得細菌能夠在體內繁殖而致病。研究發現，細菌莢膜多糖作為疫苗具有很好的免疫原性，可以刺激具有健全的免疫功能的成人產生抗體來抵抗具有莢膜多糖細菌的感染；但是，由于2歲以下兒童的免疫系統發育不完善，對莢膜多糖沒有免疫應答，而這一人群是受這些致病菌威脅最為嚴重人群，開發能夠保護這一人群的疫苗是醫學界的重點課題。自上世紀80年代，研究發現，當莢膜多糖以共價鍵和蛋白質結合，如破傷風類毒素、白喉類毒素或者CRM197(變異白喉無毒毒素)后，形成多糖-蛋白結合疫苗，可在2歲以下嬰幼兒體內產生針對于莢膜多糖的免疫應答反應，自此，一種以細菌莢膜多糖接至蛋白載體的合成疫苗誕生。

目前，在市場上用于預防成年人肺炎球菌球菌感染的有23價肺炎球菌多糖疫苗，以及預防兒童的7價、10價和13價肺炎球菌多糖結合疫苗在全球范圍廣泛使用。另外，傷寒(vi)多糖疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗、4價流行性腦膜炎多糖結合疫苗也已經應用多年。

從化學結構上來看，不同的細菌具有不同的莢膜多糖，而同一種細菌不同血清型細菌也有不同的莢膜多糖，如肺炎球菌有90種不同血清型，腦膜炎球菌有A、B、C、W135和Y群，它們都具有不同化學結構的莢膜多糖。研究發現，每種莢膜多糖具有嚴格的重復性化學結構，這個化學結構可由一個單糖單位或含有最多達7-8單糖殘基組成的寡聚糖組成。這種重復性單位可為線性或含有非碳水化合物取代基團的分叉結構，這些非碳水化合物取代基團可為O-乙酰基(O-acetyl)、甘油磷酸(glycerol?phosphate)或丙酮酸(pyruvate)；另外，肺炎球菌一些莢膜多糖可能含有不常見的單糖殘基，如二氨基(diamino-)，脫氧和分叉鏈糖等。這種細菌多糖結構的多樣性，給純化這些多糖方法帶來了挑戰和困難。

用莢膜多糖來制備疫苗，包括多糖疫苗或多糖結合疫苗，都需要用符合一定質量標準的莢膜多糖作為原料來制備。為了獲得高純度的莢膜多糖，可用富有營養成分的液體培養液來發酵細菌，進而從發酵液中純化莢膜多糖，純化過程中要去除的主要污染物包括細菌蛋白，核酸和培養基成分，如果是制備肺炎球菌莢膜多糖時，還需要控制C-多糖的污染。

細菌莢膜多糖純化工藝的建立經歷了多年的發展過程，傳統方法純化莢膜多糖過程中，去除多糖溶液中的核酸污染以達到疫苗制劑所需純度要求比較困難，由于不同細菌的莢膜多糖的化學特性不同，每種細菌莢膜多糖需要用特殊方法來去除核酸污染，沒有一種方法能夠純化其它細菌的莢膜多糖。有些細菌莢膜多糖需要通過大量的乙醇來進行沉淀，同時，要用不同的有機溶劑萃取，如乙醚等，來幫助純化。乙醇沉淀通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，并將其濃度降低至比較低的水平；但是，難以降低到用于注射用的疫苗要求的水平，包括采用有機溶劑氯仿和丁醇混合溶劑或者苯酚，和多糖溶液混合，震搖4-6小時，然后，用低速離心，聚集在水相和有機相之間的變性蛋白能夠與水相中的多糖分離。不過這種方法的缺點是在萃取過程中，多糖會被降解，斷裂或者失去其原始空間構象，純化出來的多糖已經不是有效的免疫原。由于不同細菌多糖結構的多變性限制了這些分離方法的有效性。由此，得出結論是早期的傳統方法中沒有一種方法能夠有效地純化不同細菌或者血清型細菌的莢膜多糖。

盡管如此，有幾種純化出高純度和保存有其免疫原性的不同細菌莢膜多糖方法被發明，特別是在純化不同血清型肺炎球菌莢膜多糖時，這些方法能夠有效地純化出包括24種血清型莢膜多糖，包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并用于配制23價肺炎球菌多糖疫苗的莢膜多糖原料。