[發明專利]一種玉米遺傳轉化的方法

有效

• 申請號: 201210112184.1
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN103074365A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 周曉馥;徐洪偉;徐民澤
• 申請（專利權）人: 吉林師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 吉林省長春市新時代專利商標代理有限公司 22204
• 代理人: 石岱

技術領域

本發明屬于遺傳工程技術領域，涉及一種農桿菌介導轉化玉米的方法，尤其涉及一種玉米種子整體侵染的方法。

背景技術

玉米是世界主要糧食作物和重要工業原料之一,?在世界農業生產上有著舉足輕重的地位。我國為世界第二大玉米生產國，對玉米的需求與日俱增。常規育種技術已無法滿足社會對玉米新品種的迫切需求,?而基因工程的應用必將大大推進高產、優質、高抗新品種的選育進程，因此玉米的遺傳轉化研究具有明顯的應用和理論意義。已經應用的遺傳轉化技術有基因槍法、農桿菌介導法、花粉管通道法、PEG介導法、子房注射法、超聲波法、陽離子轉化法、電擊法等。其中玉米遺傳轉化主流方法是基因槍轟擊法和農桿菌介導法?；驑屴Z擊法有整合模式相對復雜、外源基因表達傳代相對不穩定、容易受技術限制的缺點。農桿菌介導法盡管有載體骨架甚至染色體片段可被轉移的缺點，但有整合模式相對簡單外源基因表達傳代相對穩定，操作簡便、成本低，也可轉移大片段等優點。因此，農桿菌介導的轉基因法是目前玉米遺傳轉化的主流方法之一。

在農桿菌介導的玉米遺傳轉化中，建立良好的受體系統是玉米遺傳轉化的重要環節,涉及提供適宜轉化的受體材料和轉基因后的細胞能否再生植株等問題。常用的受體材料包括:?外植體(?幼胚、幼胚盾片、莖尖分生組織、莖節、幼雄穗、發芽玉米種子、芽尖、胚芽鞘、花粉、小孢子胚等)?、胚性愈傷組織、由胚性愈傷組織建立的懸浮細胞系和由胚性愈傷組織或懸浮細胞系分離出的原生質體。大量研究表明，基因型是外植體形成的愈傷組織重要限制因素，受基因型限制很大，且存在著再生頻率低、再生細胞部位與感受態細胞不一致,對農桿菌侵染不敏感且實驗周期長、工作量大、培養困難等。而玉米種子不經過愈傷組織培養及再生階段，侵染后直接發育成植株，不受這些限制。

學術界普遍認為單子葉植物能否利用農桿菌轉化的關鍵因素是農桿菌能否吸附在植物細胞表面，以及外源基因是否能夠整合到植物基因組中。早期研究認為,?單子葉植物尤其是禾本科作物不是農桿菌的天然宿主,細胞缺乏農桿菌的附著位點,不能被吸附。許東輝等還從水稻中分離出一種高效抑制農桿菌生長及抑制其在水稻細胞表面附著的信號分子。Roberta等(?1995)?發現玉米等單子葉植物完全能夠被農桿菌吸附,?而且在轉化過程中加入外源酚類物質通常會提高轉化頻率。因此，農桿菌能否吸附在植物細胞表面是農桿菌轉化的關鍵限制因素之一。Schlappi?等(?1992)?用帶有玉米條斑病毒基因感染玉米幼胚和胚芽鞘,?通過農桿菌對玉米幼胚親和性的研究,?證明只有那些再生和整合能力強的感受態細胞或處于分裂時期的細胞才能整合外源DNA，得到轉化植株,?但大多數基因型玉米缺乏感受態的細胞。而玉米種子是具有潛在分生能力的組織或細胞，在其吸脹階段用含有目標基因的菌液浸泡，使其在吸脹階段將含有目標基因的菌液吸進去，在吸脹后，種子萌發，這個時期，種子中的細胞處于分裂時期，且此時細胞表面吸附有農桿菌，從而將外源基因整合到玉米基因組中。目前，這方面的研究還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有玉米遺傳轉化受體系統取材受限、工作量與難度大、再生困難、轉化周期長、效率低及如何在細胞分裂時期保證細胞表面吸附有含有目標基因的農桿菌的難點，提供一種玉米種子整體侵染的方法，以提高玉米的轉化效率。

本發明的目的是按以下技術方案實現的：

一種玉米遺傳轉化的方法，該方法是采用玉米種子整體侵染的方法實現的，步驟包括：①、測成熟玉米種子的生理吸脹曲線，②、目標發根農桿菌的培養，③、玉米種子滅菌，④、結合玉米種子的生理吸脹曲線，將經消毒滅菌的玉米種子轉入到OD₆₀₀值為0.2-0.5左右的發根農桿菌的菌液中振蕩侵染18-21小時，⑤、在25℃黑暗條件下共培養3天，⑥、?移栽侵染植株，⑦、轉基因植株分子檢測；其中：

?步驟①所述測成熟玉米種子的生理吸脹曲線的方法是：取12份等量的成熟玉米種子，每隔3小時取1份浸泡到水中，分別浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小時，記錄玉米種子不發生損傷的吸脹停滯點為18-24小時；