[發明專利]一種玉米遺傳轉化的方法

有效

• 申請號: 201210112184.1
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN103074365A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 周曉馥;徐洪偉;徐民澤
• 申請（專利權）人: 吉林師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 吉林省長春市新時代專利商標代理有限公司 22204
• 代理人: 石岱

1.一種玉米遺傳轉化的方法，其特征在于：該方法采用玉米種子整體侵染的方法實現，步驟包括：①測成熟玉米種子的生理吸脹曲線，②目標發根農桿菌的培養，③玉米種子滅菌，④結合玉米種子的生理吸脹曲線，將經消毒滅菌的玉米種子轉入到OD₆₀₀值為0.2-0.5發根農桿菌的菌液中振蕩侵染18-21小時，⑤在25℃黑暗條件下共培養3天，⑥移栽侵染植株，⑦轉基因植株分子檢測。

2.根據權利要求1所述的一種玉米遺傳轉化的方法，其特征在于：

步驟?①所述測成熟玉米種子的生理吸脹曲線的方法是：取12份等量的成熟玉米種子，每隔3小時取1份浸泡到水中，分別浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小時，記錄玉米種子不發生損傷的吸脹停滯點為18-24小時；

步驟?②?所述目標發根農桿菌培養的方法是：將發根農桿菌在LB固體培養基平板上接種活化二次，之后挑取單菌落接種到5?ml?含有?20?ug·ml^-1利福平和50?ug·ml^-1卡那霉素的LB液體培養基中，在溫度26^oC、振蕩轉速160-200?rpm?的條件下，培養5-8小時，然后取1?ml?轉接于40?ml?含有20?ug·ml^-1?利福平、50?ug·ml^-1卡那霉素和200?umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液體培養基中，在溫度26^oC、振蕩轉速160-200?rpm?的條件下，培養12-16小時后；用含20?ug·ml^-1?利福平、50?ug·ml^-1卡那霉素和?200?umol·L^-1乙酰丁香酮的LB液體培養基稀釋上述菌液至OD₆₀₀=0.2-0.5備用；

步驟④所述結合玉米種子的生理吸脹曲線，侵染玉米種子18-21小時的方法是：結合玉米種子的生理吸脹曲線，將經消毒滅菌的成熟玉米種子轉入到裝有步驟②制備好的發根農桿菌菌液的無菌器皿中，農桿菌菌液量以剛浸沒玉米種子為準，用封口膜封住瓶口，置于搖床中，在溫度26^oC、振蕩轉速166?rpm條件下，培養18-21小時；

步驟?⑤?所述的共培養的方法是：待步驟?④侵染18-21小時后，倒掉菌液，加入無菌水沖洗3遍后，置于共培養培養基上，25℃黑暗條件下，共培養3天；

步驟?⑥所述移栽侵染植株的方法是：當步驟?⑤獲得的種子萌發的苗長達到1-2?cm時，用鑷子將種子夾出，用含150?mg·L^-1頭孢霉素的溶液浸泡1-2分鐘后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周內用含150?mg·L^-1頭孢霉素的溶液澆水，保持土壤濕度80%左右，且置于有一定光照的陰涼處，不可被陽光直射，2周后，栽入大花盆中，在溫室中培養。