[發(fā)明專利]一種藻類RNA提取劑及使用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210111477.8
• 申請(qǐng)日: 2012-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN102807978A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付萬冬;廖妙飛;周宇芳;楊會(huì)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省海洋開發(fā)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.?一種藻類RNA提取劑，其特征在于，所述藻類RNA提取劑由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和檸檬酸鈉溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的終濃度為0.05-0.2?mol/L，NaCl的終濃度為1.5-2.5?mol/L，EDTA的終濃度為0.03-0.06?mol/L，CTAB的終濃度為0.05-0.15?mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30?mmol/L，藻類RNA提取劑的終濃度為30-80?mmol/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種藻類RNA提取劑，其特征在于，所述DEPC水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%-0.2%。

3.一種權(quán)利要求1所述的藻類RNA提取劑應(yīng)用于提取藻類RNA的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟：

步驟a）處理樣品：將新鮮或超低溫冷凍的藻類，用純凈水沖洗干凈，然后瀝干；取瀝干后的藻類0.1-0.5g，在液氮中研磨至粉末狀；

步驟b）配制提取劑：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121℃滅菌15-20min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入2-4mol/L?的DTT至終濃度30-80m?mol/L，得到提取劑;其中Tris-HCl的終濃度為0.05-0.2?mol/L，NaCl的終濃度為1.5-2.5?mol/L，EDTA的終濃度為0.03-0.06?mol/L，CTAB的終濃度為0.05-0.15?mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30?mmol/L；

步驟c）抽提：將步驟a）的粉末狀樣品倒入盛有2-4mL提取劑的離心管中，渦旋混勻2-4min，將離心管在室溫下放置15-30min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，然后于0-4℃，離心力10000-15000g的條件下離心15-30min；吸取上清液于另一干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%-40%的無水乙醇，渦旋混勻2-4min；然后向加入了無水乙醇的上清液中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，于0-4℃，離心力10000-15000g的條件下離心15-30min；

步驟d）：吸取步驟c）抽提后的上清液于干凈離心管內(nèi)，加入上清液體積20%-40%的12?mol/L?LiCl溶液并渦旋混勻2-4min，-50—-80℃條件下靜置30-60min，得到粗樣品；

步驟e）沉淀：將步驟d）靜置后的粗樣品于0-4℃，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40?min；棄上清液，取出沉淀，用0.5-2mL的體積分?jǐn)?shù)70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4?℃下，離心力12000g，離心10?min；

步驟f）：將步驟e）中的上清液于于0-4℃，離心力12500-15000g的條件下，離心20-40?min，取出沉淀，用0.5-2mL體積分?jǐn)?shù)70%-75%的乙醇溶液清洗沉淀，之后于0-4?℃下，離心力12000g，離心10?min將該次離心得到的沉淀與步驟e）得到的沉淀合并得到粗沉淀；

步驟g）：將步驟f）處理后的粗沉淀在10-30℃下風(fēng)干，然后用20-50μL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%-0.2%的DEPC水溶液溶解風(fēng)干后的沉淀，用RNase-Free?DNase?set（50）試劑盒去除樣品總RNA中DNA；

????步驟h）：將步驟g）去除DNA后的樣品總RNA移入干凈離心管，加入與樣品總RNA等體積的氯仿與異戊醇混合液進(jìn)行抽提，0-4?℃，離心力12000g的條件下離心10?-25min；取上清液，移入新離心管內(nèi)，加入上清液體積10%-15%的3-5?mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH4-5，然后加入2-3倍上清液體積的無水乙醇，在-70℃冰浴沉淀45-60min；然后在0-4?℃，離心力12,000g的條件下離心10?min，棄上清液，沉淀即為純化的藻類RNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種藻類RNA應(yīng)用于藻類RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步驟c）與步驟h）中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種藻類RNA應(yīng)用于藻類RNA提取的使用方法，其特征在于，所述步驟a）中所用藻類為紅藻、綠藻或褐藻。