[發明專利]一種藻類RNA提取劑及使用方法

有效

• 申請號: 201210111477.8
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102807978A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 付萬冬;廖妙飛;周宇芳;楊會成
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋開發研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種藻類RNA提取劑及使用方法。

背景技術

分離獲得高純度、完整的RNA是進行RT-PCR、qRT-PCR、Northern雜交等分生物學實驗的關鍵。藻類組織通常富含的多糖、酚類化合物等，可在核酸分離純化時，與RNA相互作用。酚類化合物極易被氧化，生成物（如醌類）能與RNA穩定的結合，從而影響RNA的分離純化。多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來，多糖可以抑制很多酶的活性，因此污染了多糖多酚的RNA無法用于進一步的分子生物學研究。RNA酶的高穩定性是造成RNA極易降解和分離純化失敗的另外一個主要原因。RNA提取過程中污染的RNA酶有兩種來源：外源性RNA酶和內源性RNA酶。外源性RNA酶來自RNA制備過程中使用的玻璃、塑料制品和試劑及操作人員本身等，而內源性RNA酶是組織本身所固有的，當細胞破碎后即釋放出來。因此，能否有效去除多糖、酚類化合物及去除或抑制RNA酶活性是提取高質量RNA成敗的關鍵。目前，現有的RNA提取試劑盒和提取方法主要針對提取微生物、動物和高等植物組織的RNA，而對提取藻類RNA效果不佳。

中國專利公布號CN?102191239?A，公布日2011年9月21日，名稱為一種提取荔枝總RNA的方法，該申請案公開了一種提取荔枝總RNA的方法，是將采集的用液氮處理的荔枝葉片樣品經研磨后用丙酮進行抽提；在抽提過的植物材料中加入RNA提取液進行提取，離心，將上清液用LiCl進行沉淀，離心后收集沉淀；用LiCl溶液洗滌沉淀，離心，棄上清；待沉淀干燥后，用DEPC滅菌溶劑溶解沉淀，在-80℃中保存備用。其不足之處在于，現有RNA提取試劑對于藻類RNA的提取效果較差。

發明內容

本發明的目的在于為了解決現有RNA提取試劑盒對藻類RNA提取效果較差的缺陷而提供一種高效高純的藻類RNA提取劑。

本發明的另一目的是為了提供一種高效高純的藻類RNA提取劑的使用方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種藻類RNA提取劑，所述藻類RNA提取劑由Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB、DTT、和檸檬酸鈉溶于DEPC水溶液中而成；其中，Tris-HCl的終濃度為0.05-0.2?mol/L，NaCl的終濃度為1.5-2.5?mol/L，EDTA的終濃度為0.03-0.06?mol/L，CTAB的終濃度為0.05-0.15?mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30?mmol/L，藻類RNA提取劑的終濃度為30-80?mmol/L。

作為優選，所述DEPC水溶液的質量分數為0.1%-0.2%。

????一種利用藻類RNA提取劑應用于提取藻類RNA的使用方法，所述使用方法包括以下步驟：

步驟a）處理樣品：將新鮮或超低溫冷凍的藻類，用純凈水沖洗干凈，然后瀝干；取瀝干后的藻類0.1-0.5g，在液氮中研磨至粉末狀；

步驟b）配制提取劑：向Tris-HCl、NaCl、EDTA、CTAB與檸檬酸鈉中加入質量分數為0.1-0.2%的DEPC水溶液，然后在室溫下靜置過夜，在121℃滅菌15-20min，得到提取劑半成品；向提取劑半成品中加入2-4mol/L?的DTT至終濃度30-80m?mol/L，得到提取劑;其中Tris-HCl的終濃度為0.05-0.2?mol/L，NaCl的終濃度為1.5-2.5?mol/L，EDTA的終濃度為0.03-0.06?mol/L，CTAB的終濃度為0.05-0.15?mmol/L，檸檬酸鈉的終濃度為25-30?mmol/L；

步驟c）抽提：將步驟a）的粉末狀樣品倒入盛有2-4mL提取劑的離心管中，渦旋混勻2-4min，將離心管在室溫下放置15-30min，期間每隔5min搖晃離心管一次；然后向離心管中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，然后于0-4℃，離心力10000-15000g的條件下離心15-30min；吸取上清液于另一干凈離心管內，加入上清液體積20%-40%的無水乙醇，渦旋混勻2-4min；然后向加入了無水乙醇的上清液中加入2-4mL的氯仿與異戊醇的混合液，渦旋混勻2-4min，于0-4℃，離心力10000-15000g的條件下離心15-30min；

步驟d）：吸取步驟c）抽提后的上清液于干凈離心管內，加入上清液體積20%-40%的12?mol/L?LiCl溶液并渦旋混勻2-4min，-50—-80℃條件下靜置30-60min，得到粗樣品；