[發明專利]一種基于電化學hairpin DNA生物傳感器的9-羥基芴測定方法

有效

• 申請號: 201210111457.0
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102680549A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 劉新會;梁剛;李曉宏;鞏文雯;劉冠男;陶莉
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/26
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技術領域

本發明屬于電化學檢測和化學傳感器技術領域，涉及一種基于hairpin?DNA生物傳感器的制備及將所制備的傳感器用于檢測9-羥基芴。?

背景技術

羥基芳香烴類化合物作為芳烴類化合物的衍生物，因具有較強的生物毒性和環境危害性而備受人們關注，一些芳香酚類污染物已被列入優先監測黑名單中。由于其用途極為廣泛，在許多工業領域諸如煤氣、焦化、煉油、冶金、機械制造、玻璃、石油化工、木材纖維、化學有機合成工業、塑料、醫藥、農藥、油漆等工業排出的廢水中均含有羥基酚，因此預防其污染的工作也很困難，如直接排放則可污染大氣、水、土壤和食品，因此對其在環境中的監測具有重要意義。?

應用傳統的檢測手段，如氣相色譜、液相色譜、液-質色譜聯用、熒光光譜法等可以實現對羥基酚類污染物的離線分析，但是具有設備昂貴、測試費時等缺點。近年來，隨著電化學技術的迅速發展，采用電化學DNA生物傳感方法對環境污染物的檢測已成為研究熱點之一。應用DNA生物傳感器具有能夠特異性識別小分子的特點，可以實現對羥基酚類物質的檢測，此外還具有性能穩定、受環境干擾和限制少、操作簡單且靈敏度等優點，諸多優勢使得電化學DNA生物傳感器作為一種新型的檢測技術被應用于環境監測領域。Marrazza等采用天然小牛胸腺DNA修飾的石墨絲網印刷電極生物傳感器，采用計時溶出伏安法實現了對雙酚進行的測定，研究發現采用單鏈DNA制備的傳感器作用的響應信號要比和雙鏈DNA傳感器作用的信號強。Prabhakar等應用天然小牛胸腺DNA修飾的聚吡咯-聚氯乙烯磺酸鹽/氧化銦膜修飾電極的傳感器實現了對3-氯酚的檢測，鳥嘌呤氧化峰電流與濃度具有較好的線性關系，檢測限達到亞微摩爾。Yang等采用酸變性的天然小牛胸腺DNA修飾的氧化玻碳電極(GCE_(OX))傳感器實現了對1-萘酚的檢測，檢測限達到5nM。Zheng等結合納米技術，將天然鯡魚精DNA修飾到多壁碳納米管(MCNTs)修飾的玻碳電極(GCE)表面制備成DNA/MWNTs/GCE傳感器，實現了對苯酚，甲基酚，兒茶酚等酚類污染物的測定，檢測限達到微摩爾數量級，此傳感器不足之處是對酚類化合物不具有選擇性。?

目前，利用電化學DNA生物傳感器對羥基芳香烴類化合物的檢測還比較少，且主要是應用天然的DNA序列，雖然這些DNA傳感器具有高靈敏性，但是對酚類化合物不具有選擇性，且通過吸附作用修飾到電極表面的DNA膜均一性和穩定性較差。到目前為止，應用人工合成的硫修飾的DNA傳感器對羥基酚類化合物的檢測還未見報道，含硫修飾的DNA通過金-硫鍵作用自組裝修飾到金電極表面，DNA膜結構高度有序，穩定性好，且人工合成的DNA可以對堿基進行調整，設計專一性、靈敏性較高的DNA生物傳感器，有利于實現對混合體系中目標物的選擇性分析檢測，因而開發出一種能對某一種羥基化合物具有特殊選擇性的DNA傳感檢測技術，在完善我國現有檢測技術手段具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于通過金-硫鍵自組裝到金電極表面的hairpin?DNA傳感器從而能快速檢測9-羥基芴的方法。本發明所提供的電極的制備方法條件溫和，操作簡單，穩定性好，且運用此法制備的hairpin?DNA電極對9-羥基芴的檢測具有高靈敏性，選擇性的優點。?

本發明的第一方面，涉及一種hairpin?DNA修飾的金電極的制備方法，具體包括下列步驟：?

1)電極的預處理與活化：?

將金電極在鹿皮拋光布上用0.05μm的α-Al₂O₃粉末拋光至鏡面，拋光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，每次2～3min，重復三次；然后在0.5mol/L?H₂SO₄溶液中經循環伏安掃描至穩定，最后用去離子水沖洗干凈，氮氣吹干，即可得到表面干凈的金電極；?

2)Hairpin?DNA溶液的配制：?

將固體hairpin?DNA用pH＝7.4的高離子強度Tris-NaClO₄緩沖溶液(Tris濃度為20mM，NaClO₄濃度為300mM)溶解并稀釋到一定濃度，并用漩渦振蕩器混勻，于室溫下靜置12h，備用；?

3)Hairpin?DNA修飾電極的制備?