[發(fā)明專(zhuān)利]一種提高靈芝菌絲體中總黃酮產(chǎn)量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210110969.5
• 申請(qǐng)日: 2012-04-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102618594A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚強(qiáng);宮志遠(yuǎn);單洪濤;韓建東;王琦;高能;孫濤;萬(wàn)魯長(zhǎng);任鵬飛;李瑾;任海霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12P17/06
• 分類(lèi)號(hào): C12P17/06;C07K14/415;C07K1/14;C12R1/645
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及一種利用擴(kuò)張蛋白提高靈芝菌絲體中總黃酮產(chǎn)量的方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

靈芝(Ganoderma?lucidum)是擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganodelma)真菌赤芝Ganoderma.lucidum·karst和紫芝Ganoderma.japonicrn?Lloyd的總稱，具有扶正固本等功效，被《本經(jīng)》稱為上品。靈芝作為擁有數(shù)千年藥用歷史的中國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，具備很高的藥用價(jià)值，經(jīng)過(guò)科研機(jī)構(gòu)數(shù)十年的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，靈芝對(duì)于增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護(hù)肝，促進(jìn)睡眠等方面均具有顯著療效，醫(yī)學(xué)證明赤靈芝、紫芝、云芝藥用價(jià)值最高。近年來(lái)，對(duì)靈芝屬真菌的化學(xué)成分及臨床研究頗多，其中黃酮類(lèi)物質(zhì)成分的功效是多方面的，是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，黃酮類(lèi)物質(zhì)阻止氧化的能力是維生素E的十幾倍以上，可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生。天然黃酮類(lèi)化合物多以苷類(lèi)形式存在，并且由于糖的種類(lèi)、數(shù)量、聯(lián)接位置及聯(lián)接方式不同可以組成不同的黃酮苷類(lèi)。黃酮類(lèi)化合物作為保健產(chǎn)品首次引起國(guó)際醫(yī)藥界的注意是在廿世紀(jì)八十年代末。實(shí)驗(yàn)證明靈芝黃酮可以改善血液循環(huán)，降低膽固醇，改善心腦血管疾病的癥狀，還可以降低26％的血糖和39％的三元脂肪酸丙酯，穩(wěn)定膠原質(zhì)對(duì)糖尿病引起的視網(wǎng)膜病及毛細(xì)血管脆化有很好的作用。

目前，已從靈芝中分離出10多種黃酮類(lèi)化合物，包括黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和雙氫黃酮類(lèi)等。但是，靈芝黃酮類(lèi)成分的產(chǎn)量成為抑制其應(yīng)用的限制因素，在自然界中野生靈芝十分稀少，遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。采用靈芝液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)靈芝藥用活性成分因?yàn)榫哂猩a(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種有效的方法。國(guó)內(nèi)外主要是對(duì)靈芝菌絲體培養(yǎng)生產(chǎn)活性藥用成分研究和工藝應(yīng)用主要集中在發(fā)酵條件及產(chǎn)物提取分離等層面上，整體發(fā)酵水平不高。

如專(zhuān)利文獻(xiàn)CN?1264743A(申請(qǐng)?zhí)?0111953.2)公開(kāi)了一種液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝。它采用微生物為靈芝屬Ganoderma?lucidum(Leyss?exFr.)Karst.的菌種，用液體好氧發(fā)酵法、液體好氧發(fā)酵-液體靜置培養(yǎng)法或液體靜置培養(yǎng)法進(jìn)行生產(chǎn)，可以同時(shí)獲得靈芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖和靈芝酸，靈芝酸含量可達(dá)2.8毫克/100毫克，胞內(nèi)和胞外多糖總量高達(dá)2.34克/升。該方法需要靜置培養(yǎng)誘導(dǎo)合成產(chǎn)物的過(guò)程，發(fā)酵周期長(zhǎng)，液體好氧發(fā)酵加上靜置培養(yǎng)的總發(fā)酵時(shí)間需20天以上，生產(chǎn)效率低，還不能滿足現(xiàn)代工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要。對(duì)靈芝黃酮成分的高產(chǎn)液體發(fā)酵和提取技術(shù)還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，更加限制其工業(yè)化應(yīng)用的發(fā)展。

擴(kuò)張蛋白是近年在植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型蛋白，最先是從黃瓜下胚軸伸長(zhǎng)區(qū)分離純化得到，研究表明在燕麥胚芽鞘細(xì)胞壁、栝樓根尖細(xì)胞壁、番茄、煙草、擬南芥、水稻、棉纖維、玉米、大豆等細(xì)胞壁中也有擴(kuò)張蛋白的存在，與促進(jìn)其細(xì)胞生理生長(zhǎng)，影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、授粉受精、果實(shí)軟化等生理生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)。利用重組細(xì)胞壁實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了擴(kuò)張蛋白具有誘導(dǎo)熱鈍化的離體細(xì)胞壁恢復(fù)伸展的功能，推測(cè)其能夠打斷細(xì)胞壁多聚物之間的氫鍵進(jìn)而誘導(dǎo)酸依賴的細(xì)胞壁延展和壓力松弛等生理活動(dòng)，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中生理調(diào)控、細(xì)胞壁延伸的主要生理調(diào)節(jié)物質(zhì)。但是，關(guān)于擴(kuò)張蛋白的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外均未有明確的定論，將擴(kuò)張蛋白應(yīng)用于靈芝的液體發(fā)酵生產(chǎn)，提高其黃酮類(lèi)有效成分的產(chǎn)量國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用擴(kuò)張蛋白提高靈芝菌絲體中總黃酮產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種提高靈芝菌絲體中總黃酮產(chǎn)量的方法，包括如下步驟：

(1)將靈芝菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)，得種子液；

(2)將步驟(1)制得種子液按5～10％體積比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25～30℃的條件下，液體發(fā)酵培養(yǎng)3～5天，然后加入擴(kuò)張蛋白溶液，使擴(kuò)張蛋白的濃度為0.3～2.0mg/mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)5～7天，分離，得到靈芝菌絲體；

(3)從步驟(2)制得的靈芝菌絲體中提取黃酮類(lèi)成分，得到總黃酮。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下：

去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的活化培養(yǎng)條件為：搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，暗培養(yǎng)活化3～5天。