[發明專利]一種提高靈芝菌絲體中總黃酮產量的方法

無效

• 申請號: 201210110969.5
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102618594A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 姚強;宮志遠;單洪濤;韓建東;王琦;高能;孫濤;萬魯長;任鵬飛;李瑾;任海霞
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農業資源與環境研究所
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C07K14/415;C07K1/14;C12R1/645
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙龍群

1.一種提高靈芝菌絲體中總黃酮產量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將靈芝菌種接種到PD液體發酵培養基中，進行活化培養，得種子液；

(2)將步驟(1)制得種子液按5～10％體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度25～30℃的條件下，液體發酵培養3～5天，然后加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為0.3～2.0mg/mL，然后繼續培養5～7天，分離，得到靈芝菌絲體；

(3)從步驟(2)制得的靈芝菌絲體中提取黃酮類成分，得到總黃酮。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的活化培養條件為：搖床轉速100～180r/min，溫度25～30℃，暗培養活化3～5天。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發酵培養基，每升組分如下：

乳糖20g，蔗糖20g，黃豆粉25g，蛋白胨2g，酵母浸膏1g，MgSO₄·7H₂O?0.5g，KH₂PO₄0.5g，水定容至1000mL，pH?6.0。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為0.5～2.0mg/mL；

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為0.75～1.75mg/mL。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為1.5mg/mL。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液制備方法如下：

將大豆或黃瓜種子經0.05～0.15wt％HgCl2消毒4～6min，流水沖洗5～7h，然后，25～28℃暗培養4～6天；剪取幼苗下胚軸頂端3～4cm，置-20℃預冷0.5h，加預冷至4℃的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70μm的尼龍網過濾，濾渣經勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置1～3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，過濾，按0.3～0.5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH₄)₂SO₄，添加(NH₄)₂SO₄過程中不斷攪拌，防止(NH₄)₂SO₄局部過飽和，然后靜置45～50h，4℃條件下25000g離心5～10min，沉淀用酸性緩沖液復溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液經20000g離心10min，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，上述擴張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為：25mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.5mmol/LNa₂S₂O₅，2mmol/LEDTA，0.1wt％Triton?X-100，pH?7.0；所述提取液組分為：15mmol/L?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，1.5mmol/L?Na₂S₂O5，0.5mol/L?NaCl，pH?6.0；所述酸性緩沖液配制是：將2.05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調節pH至4.0，水定容至1L。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離方法為：4℃15000r/min條件下離心分離10min。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中靈芝菌絲體中提取黃酮類成分的方法按如下步驟如下：

將步驟(2)制得的靈芝菌絲體65℃烘干，研成粉末，加入70～80％乙醇，60～70℃、40kHz功率200W條件下，超聲提取3～5h，過濾，取濾液，濾渣重復上述超聲提取、過濾步驟2～3次，合并濾液，即得黃酮類成分。